T_ZNZ 286-2024 土壤中抗生素抗性基因检测 高通量荧光定量PCR 法.docxVIP

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T/ZNZ

浙江省农产品质量安全学会团体标准T/ZNZ286—2024

土壤中抗生素抗性基因检测高通量荧光

定量PCR法

High-throughputquantitativePCRmethodfordetectionofantibiotic

resistancegenesinsoil

2024-08-28发布2024-09-28实施

浙江省农产品质量安全学会发布

I

T/ZNZ286—2024

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

本文件由浙江省农产品质量安全学会提出并归口。

本文件起草单位：中国科学院城市环境研究所、武汉工程大学。

本文件主要起草人：苏建强、李欢琴、安新丽、李雅颖、姚槐应。

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1

土壤中抗生素抗性基因检测高通量荧光定量PCR法

1范围

本文件规定了土壤中抗生素抗性基因检测高通量荧光定量PCR法的方法。

本文件适用于土壤中抗生素抗性基因的检测。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T41689土壤质量土壤样品直接提取DNA的方法

NY/T1121.1土壤检测第1部分：土壤样品的采集、处理和贮存

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

抗生素抗性基因antibioticresistancegenes

存在于细菌或其他微生物基因组中的基因，具有降低抗生素效果或完全失效的能力。3.2

高通量荧光定量PCRhigh-throughputquantitativepolymerasechainreaction,HT-qPCR

基于微孔芯片进行高通量、纳升级别的实时荧光定量PCR方法。

3.3

可移动遗传元件mobilegeneticelements

在基因组中可扩散或转移的遗传元件，如质粒、噬菌体、整合子、插入序列和整合接合元件等。3.4

Ct值cyclethreshold

每个反应体系中荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。

3.5

基因拷贝数genecopynumber

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2

某一种基因或某一段特定的DNA序列在单倍体基因组中出现的数目。

4原理

基于纳升级微孔芯片，在PCR反应体系中，加入特异性引物，随着PCR反应的进行，核酸染料不断与PCR产物结合，发出荧光信号，PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一次荧光强度信号，这样就可以通过荧光强度变化来监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线。在PCR扩增结束后，增加溶解曲线的步骤，监测扩增产物的特异性情况。基因的Ct值与基因起始拷贝数的对数存在线性关系。因此，收集未知样品微生物并提取其DNA，经PCR反应获得该样品的Ct值，即可根据建立的标准曲线，用标准质粒内标法计算出该样品的相应抗生素抗性基因的起始拷贝数。

5设备与材料

5.1设备

5.1.1高通量荧光定量PCR仪。

5.1.2冷冻离心机。

5.1.3涡旋仪。

5.1.4核酸定量仪。

5.1.5荧光成像系统。

5.1.6多样品纳米分配器。

5.2材料

5.2.1高通量荧光定量芯片。

5.2.2384方孔板。

5.2.3封板膜。

5.2.4平底96孔板。

5.2.5SYBRGreenIMaster。

5.2.6牛血清白蛋白溶液：50mg/mL。

5.2.7超纯水。

5.2.8加样槽。

5.2.9抗生素抗性基因引物。

5.2.10次氯酸钠溶液：有效氯终浓度0.2%。

5.2.11TE缓冲液：pH8.0。

5.2.12双链DNA超敏检测试剂盒。

5.2.13DNA纯化试剂盒。

5.2.14DNA连接试剂盒。

5.2.15质粒提取试剂盒。

6测定步骤

6.1土壤样品采集

按照NY/T1121.1采集土壤样品。

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3

6.2DNA提取

按GB/T41689提取样品中的DNA。样品DN