原创力文档- 1、原创力文档（book118）网站文档一经付费（服务费），不意味着购买了该文档的版权，仅供个人/单位学习、研究之用，不得用于商业用途，未经授权，严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等，侵权必究。。
- 2、本站所有内容均由合作方或网友上传，本站不对文档的完整性、权威性及其观点立场正确性做任何保证或承诺！文档内容仅供研究参考，付费前请自行鉴别。如您付费，意味着您自己接受本站规则且自行承担风险，本站不退款、不进行额外附加服务；查看《如何避免下载的几个坑》。如果您已付费下载过本站文档，您可以点击 这里二次下载。
- 3、如文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等，请点击“版权申诉”（推荐），也可以打举报电话：400-050-0827(电话支持时间：9:00-18:30)。
- 4、该文档为VIP文档，如果想要下载，成为VIP会员后，下载免费。
- 5、成为VIP后，下载本文档将扣除1次下载权益。下载后，不支持退款、换文档。如有疑问请联系我们。
- 6、成为VIP后，您将拥有八大权益，权益包括：VIP文档下载权益、阅读免打扰、文档格式转换、高级专利检索、专属身份标志、高级客服、多端互通、版权登记。
- 7、VIP文档为合作方或网友上传，每下载1次， 网站将根据用户上传文档的质量评分、类型等，对文档贡献者给予高额补贴、流量扶持。如果你也想贡献VIP文档。上传文档
演讲人：
日期:
质粒的提取技术
CATALOGUE
目录
01
概述与基本原理
02
实验前准备
03
细胞裂解技术
04
DNA纯化过程
05
检测与验证方法
06
优化与问题处理
01
概述与基本原理
质粒的定义与结构特征
质粒是独立于宿主染色体外的双链环状DNA分子，大小通常在1-200kb之间，具有自主复制起始位点（ori），可在宿主细胞内稳定维持特定拷贝数。
自主复制的环状DNA
携带功能性基因
结构多样性
质粒常携带抗生素抗性基因、代谢酶基因或毒力因子等，赋予宿主菌特殊表型（如氨苄青霉素抗性），在自然选择压力下具有生存优势。
除常见的共价闭合环状（cccDNA）构型外，还存在线性质粒（如某些放线菌）和松弛型开环DNA（ocDNA），其超螺旋程度影响电泳迁移率。
提取目的与生物应用
基因克隆载体构建
提取的质粒经酶切、连接后可作为重组DNA载体，用于外源基因的克隆与表达（如pET系列载体在大肠杆菌中的蛋白表达）。
分子生物学研究基础
质粒提取是PCR模板制备、测序、定点突变等实验的前提步骤，确保高纯度DNA用于下游操作。
工业与医学应用
质粒DNA可用于疫苗开发（如DNA疫苗）、基因治疗载体（如AAV辅助质粒）及抗生素耐药性监测。
提取流程总体框架
细菌培养与裂解
通过LB培养基扩增含质粒的宿主菌，利用碱性裂解法（SDS+NaOH）破坏细胞壁，释放质粒及染色体DNA。
02
实验前准备
细胞培养与收集步骤
细胞培养条件优化
选择适合宿主菌株的培养基（如LB培养基），控制培养温度、摇床转速和培养时间，确保细胞处于对数生长期以提高质粒产量。
细胞收集与离心
通过离心（如6000×g，10分钟）收集菌体，弃上清后用预冷的PBS缓冲液洗涤1-2次，去除残留培养基成分，避免干扰后续裂解步骤。
菌体重悬处理
使用含有RNaseA的裂解缓冲液（如SolutionI）重悬菌体，充分涡旋混匀至无可见团块，确保细胞均匀分散以提升裂解效率。
试剂与缓冲液配制要求
裂解缓冲液配制
洗涤缓冲液要求
中和缓冲液配制
SolutionI需包含Tris-HCl（pH8.0）、EDTA和葡萄糖，严格按比例配制并过滤除菌；SolutionII（碱裂解液）需现配现用，避免氢氧化钠与SDS长时间混合导致失效。
SolutionIII需含乙酸钾和冰醋酸，配制后需检测pH值（约5.5），确保能有效沉淀蛋白质和基因组DNA，避免质粒损伤。
70%乙醇需用无核酸酶水配制，用于去除残留盐分；洗脱缓冲液（如TE或无菌水）需预热至55℃以提高质粒洗脱效率。
离心机与转子选择
过滤与纯化耗材
辅助工具清单
设备与耗材标准清单
需配备高速冷冻离心机（最高转速≥12000×g）及适配的角转子和水平转子，以满足不同步骤的离心需求。
使用0.22μm无菌滤器过滤缓冲液；质粒纯化柱需具备高结合容量（如≥20μgDNA/柱）和低内毒素特性，确保质粒纯度符合转染要求。
微量移液器（覆盖1μL-1000μL范围）、无菌EP管、涡旋振荡器及水浴锅（控温精度±1℃）为必备工具，需定期校准和维护。
03
细胞裂解技术
碱裂解方法详解
碱裂解原理
利用高pH值的碱性溶液（如NaOH-SDS）破坏细胞膜和核膜，使染色体DNA变性并与质粒DNA分离，随后通过中和反应使质粒DNA复性并保留在溶液中。
01
关键试剂作用
SDS作为去垢剂溶解细胞膜，NaOH使DNA双链解旋，醋酸钾中和后质粒DNA因结构完整而重新形成超螺旋结构，而染色体DNA因断裂形成沉淀。
操作步骤优化
裂解时间需严格控制，过短导致细胞裂解不彻底，过长则可能引起质粒不可逆损伤；离心速度和时间影响沉淀与上清的分离效率。
适用范围
适用于大多数革兰氏阴性菌（如大肠杆菌），但对某些革兰氏阳性菌或含复杂细胞壁的微生物需结合其他裂解方法。
02
03
04
酶解与其他裂解途径
包括超声破碎、高压匀浆或玻璃珠震荡，适用于难以裂解的微生物或大规模提取，但可能因剪切力导致大质粒断裂。
机械裂解法
热裂解技术
化学裂解替代方案
通过溶菌酶降解细菌细胞壁中的肽聚糖层，适用于革兰氏阳性菌或对碱敏感的菌株，常与SDS或热休克联用提高裂解效率。
通过反复冻融或高温处理破坏细胞结构，操作简单但质粒得率较低，适用于小规模快速提取。
使用胍盐或离液剂（如异硫氰酸胍）直接裂解细胞并稳定核酸，适用于高通量自动化提取系统。
溶菌酶处理
裂解条件优化要点
裂解液的pH需精确调整至12.0-12.5以充分变性DNA，中和时醋酸钾的浓度和pH（约5.5）直接影响质粒复性效果。
pH与离子强度调控
对数生长期的细胞裂解效率最高，菌体过量可能导致裂解不彻底或杂质增多，OD600控制在1.0-1.5为佳。
细胞状态与密度
裂解过程应在冰浴中进行以防止局部过热导致质粒
文档评论（0）