已知基因序列的获取方法讲课文档.pptVIP

已知基因序列的获取方法;一、如何获取已知目的基因的序列信息;;;二、目的基因cDNA序列的获取方法;组织RNA的提取;RNA提取两要素;尽量减少RNAase污染;如何确认RNA的质量;28S;RT引物的选用;RT中提高合成全长cDNA的效率;;高保真DNA多聚酶的选用;载体构建中的常见问题;真核表达载体的选择;第十七页，共57页。;第十八页，共57页。;第十九页，共57页。;一个载体内的多基因表达;SOE技术与基因人工合成及多基因融合;SOE：Splicedbyoverlappingextension;第二十三页，共57页。;第二十四页，共57页。;搭桥技术融合基因;三、引物设计;引物设计注意事项;5’端序列的修饰与标记：可在引物设计时加上限制酶位点、核糖体结合位点、起始密码子、缺失或插入突变位点以及标记生物素、荧光素、地高辛等.通常应在5‘端限制酶位点外再加1-3个保护碱基。

简并引物：应选用简并程度低的密码子,例如选用只有一种密码子的Met,3’端应不存在简并性。否则可能由于产量低而看不见扩增产物。

同源性或互补性：两引物间最好不存在4个连续碱基的同源性或互补性。

GC含量：一般为40-60%。另外，上下游引物的GC含量不能相差太大。;Tm值：引物所对应模板位置序列的Tm值在72℃左右可使复性条件最佳。有多种计算方法，如按公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T)，在软件中常使用的是最邻近法(thenearestneighbormethod)。

△G值：指DNA双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用3’端△G值较低（绝对值不超过9），而5’端和中间△G值相对较高的引物。引物的3’端的△G值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过4.5kcal/mol）易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。;PrimerPremier5.0;第三十一页，共57页。;;第三十三页，共57页。;第三十四页，共57页。;;Oligo6.69;四、测序图比对、拼接与虚拟克隆(insilicocloning);;第三十九页，共57页。;第四十页，共57页。;第四十一页，共57页。;第四十二页，共57页。;常用序列拼接软件;开始→所有程序→DNAstar→SeqMan;添加序列;;;点开测序图;保存结果;运行VNTI程序ContigExpress;导入测序结果??文件扩展名ab1改成abi）相关软件EditViewforMacs；ChromaforWindows];导入后可以双击查看和编辑各个测序结果;选择序列，根据实际情况调整序列末端;选择序列拼接;双击查看结果;输出结果到剪贴板，注意最上面的像机按钮，直观吧。;谢谢大家！