cDNA文库的构建优质课件.pptVIP

4、加药完成后，微型离心机离心10s左右。放置于PCR反应孔中，设置程序后开始反应。5、琼脂糖凝胶电泳分析PCR结果(1)PCR反应完成后，配制50ml1％的琼脂糖凝胶。(2)取1微升反应完成的样品+5微升6*loading-buffer混合均匀后点样。(3)利用琼脂糖凝胶电泳分析PCR结果。(4)PCR反应完成后的样品4℃下短时间保存。-20℃下可以保存数周。双链cDNA连接到质粒或噬菌体载体并导入大肠杆菌中繁殖

将合成的双链重组到质粒载体或噬菌体载体上,转化大肠杆菌寄主细胞增殖.1,同聚物加尾法利用小牛胸腺末端转移酶在双链cDNA和质粒载体的3-端都加上一个互补的同聚片段,通过退火使两个连接片段成重组质粒,再将重组质粒转化受体细胞.同聚物加尾法克隆双链cDNA2,接头-衔接头法3,mRNA-cDNA克隆法方法:在mRNA反转录合成cDNA第一链后,将dA残基加到mRNA:cDNA杂交体上,然后与带dT尾的克隆载体连接,转化受体细胞,在宿主细胞内,mRNA被降解并代之以DNA.缺点:克隆的效率低(为双链cDNA克隆的1/10)4,Okayama-Berg法合成并克隆双链cDNA蓝白斑筛选：找出需构建的目的文库cDNA文库的构建主讲人：刘圆圆制作者：王卓答疑：栗建辉主要内容：cDNA文库构建的定义cDNA文库构建原理cDNA文库构建的过程cDNA文库构建的定义：

定义：(cDNALibrary)某种生物基因组转录的全部mRNA经反转录产生的cDNA片段分别与克隆载体重组，并将其引入到相应的宿主细胞中（一般为.）繁殖和扩增，理论上此群体就包含有该物种的全部mRNA信息，称该生物基因组的cDNA文库。cDNA文库是以特定的组织或细胞mRNA为模板，逆转录形成的互补DNA（cDNA）与适当的载体（常用噬菌体或质粒载体）连接后转化受体菌形成重组DNA克隆群，这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织或细胞的cDNA文库。cDNA文库特异地反映某种组织或细胞中，在特定发育阶段表达的蛋白质的编码基因，因此cDNA文库具有组织或细胞特异性。cDNA文库构建原理：

经典cDNA文库构建的基本原理：用Oligo（dT）作逆转录引物，或者用随机引物，给所合成的cDNA加上适当的连接接头，连接到适当的载体中获得cDNA文库。其基本步骤包括：（1）mRNA的提纯获取高质量的mRNA是构建高质量的cDNA文库的关键步骤之一。（2）cDNA第一条链的合成。（3）cDNA第二条链的合成。（4）双链cDNA的修饰。（5）双链cDNA的分子克隆。（6）cDNA文库的扩增。（7）cDNA文库鉴定评价。cDNA文库构建的过程

步骤：RNA的提取与分离第一链cDNA的合成第二链cDNA的合成双链cDNA连接到质粒或噬菌体载体并导入大肠杆菌中繁殖RNA的分离：

1、取大约1cm2植物叶片，在研钵中充分研磨后转移到1.5ml离心管。加入大约1mlTotalRNAExtrzctor。2、将裂解后样品和匀浆液室温放置5-10min。使得核蛋白与核酸完全分离。(样品中如含有较多的蛋白质、多糖、脂肪或其他细胞外基质，可以12000rpm离心10分钟，移去漂浮的油脂，取上清。)3、加入0.2ml氯仿，剧烈震荡15sec，室温放置3min。12000rmp4℃离心10min。4、吸取上层水相转移至干净的离心管中，加入等体积异丙醇，混匀，市室温放置20min。5、12000rpm4℃离心10min，弃上清。(离心前RNA沉淀通常是不可见的，离心后在管侧和管低形成胶状沉淀。)6、加入1mL75%乙醇洗涤沉淀。12000rpm4℃离心3min，弃上清室温干燥5-10min。(用1mL75%乙醇洗涤沉淀；不要倒出沉淀，剩余少量液体短暂离心，然后用枪头吸出。)7、加入20μlRNase-freeddH2O，充分溶解RNA，将所得到的RNA溶液置于-70℃保存或用于后续实验。（二）琼脂糖凝胶电泳检测DNA1、配制0.1的琼脂糖凝胶，取50ml0.5*TBE加入0.5g琼脂糖。加热溶解后，再加入5μl4sGreen。2、点样时，样品和6*loadingbuffer按照1:5的比例，混合均匀后点样。3、点样完成后，80V恒压电泳40min左右。第一链cDNA的合成：以RNA为模板在反转录酶作用下生成第一条链第一链的合成oligo(dT)引导的DNA合成法:利用真核mRNA分子所具有的poly(A)尾巴的特性,加入12-20个脱氧胸腺嘧啶核苷组成的oligo(dT)短片段,由反转录酶合成cDNA的第