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探秘sTNFRⅡ-gAD融合蛋白聚合体：从表达制备到生物学特性解析

一、引言

1.1研究背景与意义

肿瘤坏死因子-α（TNF-α）作为一种多能性细胞因子，在机体的生理过程中扮演着不可或缺的角色，深度参与免疫调节、炎症反应以及细胞增殖、分化和凋亡等重要进程。在免疫调节方面，TNF-α能够激活T细胞、B细胞等免疫细胞，增强机体的免疫应答能力，帮助机体抵御病原体的入侵。在炎症反应中，它可以促使炎症细胞的聚集和活化，释放其他炎症介质，共同调节炎症的发生和发展。正常水平的TNF-α对于维持机体的免疫平衡和内环境稳定起着关键作用。然而，当TNF-α过表达时，就会打破机体的免疫平衡，引发一系列严重的自身免疫性疾病。类风湿性关节炎便是其中具有代表性的一种，患者的免疫系统错误地攻击自身关节组织，导致关节滑膜炎症持久反复发作。这种炎症会持续侵蚀关节内的软骨和骨，造成关节功能障碍，严重时甚至会导致患者残废，给患者的生活质量带来极大的负面影响，也给社会带来了沉重的医疗负担。据统计，我国现有类风湿性关节炎患者达2000万人，其中中重度活动性患者约400多万，且该病在世界范围内普遍存在，发病率约占人群的1%-2%。

中和体内过剩的TNF-α或抑制其活性成为治疗这类自身免疫性疾病的关键策略。可溶性肿瘤坏死因子受体II（sTNFRII）作为TNF-α的天然拮抗剂，具有与TNF-α结合的能力，然而其单体形式存在明显缺陷。一方面，sTNFRII单体与TNF-α间的亲和力较低，无法高效地结合并中和TNF-α；另一方面，其在血液循环中的半衰期很短，导致其在体内的作用时间有限，这使得sTNFRII单体拮抗TNF-α的能力受到极大限制，难以满足临床治疗的需求。为了克服sTNFRII单体的不足，科研人员通过基因工程技术构建了多种融合蛋白。其中，sTNFRII-gAD融合蛋白脱颖而出，它利用了脂联素球部（gAD）可自行形成同源三聚体的独特特性。这种三聚体化的结构设计使得sTNFRII-gAD融合蛋白在与TNF-α结合时，能够更好地匹配TNF-α天然的三聚体形式，从而显著增强与TNF-α的亲和力，提高对TNF-α的中和能力。与已上市的TNF-α拮抗药物sTNFRII-Fc（二聚体形式的sTNFRII）相比，理论上sTNFRII-gAD融合蛋白具有更强的拮抗活性，在治疗类风湿性关节炎等炎症疾病方面展现出巨大的潜在价值，有望为这些疾病的治疗提供更有效的手段，改善患者的病情和生活质量。

1.2国内外研究现状

在sTNFRII-gAD融合蛋白的表达研究方面，国内外均取得了一定的进展。国内研究中，温州医学院的研究团队做出了突出贡献。他们运用RT-PCR技术，从人的外周血淋巴细胞总RNA中成功扩增出人肿瘤坏死因子II型受体胞外区基因片段，并将其与脂联素球部基因片段融合，巧妙地克隆至pAAV2neo表达载体中，构建成pAAV2neo-sTNFRII-gAD。随后，通过转染BHK-21S细胞获得G418抗性细胞BHK-21S/pAAV2neo-sTNFRII-gAD，再将细胞培养方式从贴壁培养转换为无血清悬浮培养，成功在哺乳动物细胞BHK-21S的无血清培养体系中实现了sTNFRII-gAD融合蛋白的表达。研究结果表明，该融合蛋白在细胞上清中以单体、三聚体和三聚体以上的多聚体形式存在，为后续对融合蛋白结构和功能的研究奠定了基础。此外，他们还尝试用重组腺病毒载体和BHK21细胞表达系统来制备三聚体化的sTNFRII-gAD融合蛋白。利用AdMaX腺病毒载体系统制备携带融合基因sTNFRII-gAD的重组复制缺陷型5型腺病毒rAd5-sTNFRII-gAD，以MOI100感染5个转瓶培养的BHK2lc022细胞，经过多次收获上清、硫酸铵浓缩、分子筛柱层析、透析等一系列精细的步骤，成功获得了约11mg的具有生物学活性的sTNFRII-gAD融合蛋白，建立了一个简便、高效、通用的腺病毒载体/BHK21细胞表达系统。

国外在这一领域也有相关探索，部分研究集中在优化表达系统以提高融合蛋白的产量和活性。一些研究尝试使用不同的细胞系和表达载体，通过调整培养条件和表达策略，来实现sTNFRII-gAD融合蛋白的高效表达。例如，有研究采用特定的CHO细胞系，通过优化培养基成分和培养工艺，提高了融合蛋白的表达水平和稳定性，但在融合蛋白的三聚体形成效率和活性保持方面仍存在一定的提升空间。

在制备工艺方面，国内外的研究主要围绕如何提高