免疫细胞的分离与功能测定.pptVIP

间接红细胞花环法抗CD3、抗CD4、抗CD8分别与去除粘附细胞的PBMC作用，加入SRBC-兔抗鼠IgG偶联物作用，染色后镜检200个淋巴细胞，计算花环形成细胞百分率五淋巴细胞功能测定㈠淋巴细胞增殖试验非特异性刺激物PHA、ConA、PWM、SPA、LPS，胃蛋白酶、胰蛋白酶等蛋白质，抗CD2、抗CD3、抗IgM等细胞表面标志的抗体，及某些细胞因子特异性刺激物特异性抗原1.丝裂原刺激的淋巴细胞增殖试验丝裂原→淋巴细胞→淋巴母细胞⑴3H-TdR掺入试验SI﹦试验组cpm/对照组cpm⑵形态学方法结果以淋巴细胞转化率表示⑶MTT比色法琥珀酸脱氢酶→MTT→甲月赞+盐酸异丙醇或二甲基亚砜→溶解后测OD值SI﹦试验组OD均值/对照组OD均值2.混合淋巴细胞培养单向混合淋巴细胞培养双向混合淋巴细胞培养可分3H-TdR掺入法、形态学方法及MTT比色法3.自身混合淋巴细胞反应4.淋巴因子诱导的细胞增殖反应如IL-4→B细胞，IL-2→T细胞5.影响细胞增殖反应的因素⑴细胞应保持高活性，⑵可溶性抗原刺激淋巴细胞增殖时，常需一定数量的抗原呈递细胞⑶不同的刺激原有不同的刺激剂量⑷严格无菌操作六NK细胞活性测定靶细胞人NK细胞K562细胞（靶细胞）鼠NK细胞YAC-1细胞（靶细胞）一外周血单个核细胞的分离

原理:密度梯度离心，利用密度为1.077±0.001g/L淋巴细胞分层液（聚蔗糖-泛影葡胺）主要步骤1无菌采集静脉血，抗凝（每1ml全血加0.1ml125～250U/ml肝素溶液）2用等体积Hanks平衡盐溶液(HBSS)或pH7.2～7.4PBS稀释3按每10ml稀释血用3～5ml淋巴细胞分层液的比例先将淋巴细胞分层液加入离心管中，再小心沿管壁缓慢加入稀释血，注意切勿使血液混入分层液42000r/min水平离心30min，5吸取分层液与血浆交界部位的单个核细胞，用5倍体积的HBSS或RPMI-1640洗涤2次依次以2000r/min，1500r/min离心10min6用完全RPMI-1640定容，计数。一般每ml健康成人血可分离出1×106～2×106单个核细胞7台盼蓝染色，检查细胞活性，活细胞应﹥95﹪。注意事项1严格无菌操作2操作应轻柔，细胞悬液应充分混匀3淋巴细胞分层液应4℃避光保存，取出后待温度升至室温使用4如须保存血浆作他用，则不能稀释血液5离心最适温度18～20℃6分离组织中的单个核细胞也可采用上法二淋巴细胞的纯化㈠红细胞的去除1低渗裂解法1ml蒸溜水加入沉淀的PBMC中，轻摇（﹤1min）立即加入1.8﹪NaCl,洗涤2氯化铵处理法沉淀的PBMC中加入1ml0.83﹪氯化铵溶液，轻摇2min，洗涤㈡血小板的去除1.PBMC经洗涤2～3次可去除大部分血小板2.胎牛血清(FCS)梯度离心1mlPBMC悬液（1×107～2×107/ml）用3mlFCS800r/min水平离心15min，18～20℃㈢单核细胞的去除

1.粘附去除法原理单核细胞可粘附在玻璃或塑料表面⑴PBMC用完全RPMI-1640调整浓度至2×106/ml⑵将50ml细胞悬液移入150cm2培养瓶，37℃5﹪CO295﹪湿度培养1h⑶收集非粘附细胞，再用预温至37℃的RPMI-1640,轻轻荡洗培养瓶并收集荡洗液⑷1300r/min离心10min，18～20℃⑸弃上清，用5～10ml完全RPMI-1640悬浮细胞计数，用台盼蓝染色检查细胞活性2.L-亮氨酸甲酯去除法溶酶体酶→L-亮氨酸甲酯→L-亮氨酸-L-亮氨酸甲酯此法也可清楚NK细胞和细胞毒性T细胞本法只适用于分离新鲜细胞⑴用PBS调整细胞浓度至3×1065×106/ml，用无血清RPMI-1640配制10mmol/L的L-亮氨酸甲酯溶液（临用时配），两液按1︰1比例混合，室温40min⑵1300r/min离心10min，用HBSS或PBS洗涤沉淀共3次⑶用完全RPMI-1640悬浮细胞，用无菌尼龙网过滤，离心并计数，调整细胞至所需浓度3.羰基铁吞噬离心法在抗凝血中加入一定量羰基铁粉，37℃搅拌15min，然后用淋巴细胞分层液离心分离亦可先分离PBMC，再加羰基铁粉分离去除单核细胞粘附法去除单核细胞后，大约95﹪为淋巴细胞，活性＞95﹪L-亮氨酸甲酯法，99﹪为淋巴细胞，活性＞95﹪三外周血淋巴