狂犬病免疫组化检测流程.docxVIP

狂犬病病毒直接快速免疫组化试验

【材料】

1．即用型生物素标记单抗20ml

2．即用型链霉亲和素-HRP复合物20ml

3．即用型醋酸盐缓冲液pH5.2，20ml

4．AEC-DMF溶液2.5ml

5．3%过氧化氢溶液1ml

6．水溶性封片剂5ml

7．阳性和阴性对照脑组织各1管，约0.3g

【检测流程】

1.自备设备与材料带有20×和40×物镜的光学显微镜、染片缸（10个）、湿盒、载玻片、盖玻片、移液器、Tip头、吸水纸、甲醛、PBS、吐温-20、苏木素染液、过氧化氢

2．检测前准备狂犬病检测人员应执行暴露前免疫，并保证血清中和抗体水平不低于1.0IU/ml。

配制如下液体，配制后室温保存：

10%福尔马林缓冲液（9体积蒸馏水加1体积36%的甲醛溶液）

磷酸盐缓冲液（PBS，NaCl8g,KCl0.2g,Na2HPO41.44g,KH2PO40.24g,定容至1L，以HCl调至pH7.4）

PBST（上述PBS，加0.5%的吐温-20，完全溶解即得）

3%的过氧化氢（9体积蒸馏水加1体积30%的过氧化氢溶液）

苏木素染液（1体积市售苏木素染液加1体积蒸馏水）

按如下顺序编号、排列染片缸并盛装相应液体（除苏木素可每周更换外，其余现用现配）：

12345678910

福尔PBST3%PBSTPBSTdH2O苏木素dH2OdH2OPBS

马林H2O2染液

3．检测操作

3.1取待检脑组织脑干、小脑及海马回三处组织少许，在载玻片上制备组织印片；同时分别取阳性和阴性对照组织（组分7），制备印片各1张。以上印片编号，室温风干5min。

3.2将所有印片浸到10%福尔马林溶液（第1缸）中，作用10分钟。

3.3取出载玻片，放入PBST溶液（第2缸）中清洗几次，以除去多余的固定剂。

3.4载玻片移入3%过氧化氢溶液（第3缸）中，作用10min，以除去内源过氧化物酶。

3.5在PBST溶液（第4缸）中清洗载玻片数次，移入下一个PBST冲洗缸（第5缸）中，清洗几次后，甩去多余缓冲液，用吸水纸从载玻片的一侧将其表面吸干，注意不得触及组织印迹。水平摆放载玻片于湿盒内（也可将载玻片置于实验台的湿纸巾上，其上覆盖96孔板盖），组织印迹处滴加生物素标记的抗狂犬病单克隆抗体（组分1）3～5滴，使充分覆盖组织印迹，室温孵育10min。

3.6孵育后甩弃多余液体，以PBST（第5缸）浸洗载玻片，甩掉多余的PBST，并从载玻片的边缘将其表面吸干，水平摆放于湿盒内。

3.7组织印迹上滴加链霉亲和素-过氧化酶复合物（组分2）3～5滴，使充分覆盖组织印迹，室温孵育10min。

孵育期间准备AEC染色液：按染片数量，每10片取醋酸盐缓冲液（组分3）2ml（约40滴），加入玻璃瓶（如青霉素瓶）内，滴入AEC-DMF溶液（组分4）6滴（约250μl），摇匀后加入3%过氧化氢2滴（80μl），摇匀后于1小时内使用。

3.8孵育后甩弃多余液体，以PBST（第5缸）浸洗载玻片甩掉多余的PBST，并从载玻片的边缘将其表面吸干，水平摆放于湿盒内。

3.9组织印迹上滴加AEC染色液3～5滴，使充分覆盖组织印迹，室温孵育10min。

3.10蒸馏水（第6缸）浸洗载玻片几次后，载玻片移入苏木素染液（第7缸）内复染2min。

3.11以蒸馏水（第8缸）浸洗载玻片以去除染色剂，再次用蒸馏水（第9缸）浸洗漂净。

3.12将载玻片移入PBS（第10缸）内返蓝，每次1张，停留5～10秒取出，甩净多余液体，以水溶性封片剂（组分6）封片，读片前置于阴暗处保存。

3.13用光学显微镜观察。以20倍物镜扫描视野，然后用40倍高倍镜观察，在蓝色的组织背景下，狂犬病毒抗原染为棕红色圆形或不规则条索状斑块）。

【判定】

1．检测成立的标准阳性对照片应有1/2以上视野内可观察到特异性棕红色斑块，且狂犬病抗原的棕红色染色与蓝色背景反差极明显；阴性对照片内不应观察到特异性棕红色斑块。

2．检测结果的判定在检测成立的前提下，1/10以上视野内可观察到特异性棕红色斑块的样品，判定为狂犬病病毒免疫组化染色阳性；1/10以下视野可观察到特异性棕红色斑块的样品，判定为狂犬病病毒免疫组化染色可疑阳性；未观察到特异性棕红色斑块的样品，判定为狂犬病病毒免疫组化染色阴性。填写下列记录表：

脑组织狂犬病快速免疫组化（dRIT）检测记