2026届高三生物二轮复习课件：生物技术与工程-素养整合 诠释应用.pptVIP

二、反向PCR技术反向PCR技术是用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段,对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。【例3】(2025·安徽芜湖二模)反向PCR是一种通过已知序列设计引物对未知序列进行扩增的技术,其过程如下图所示。下列叙述错误的是()注:引物分别与邻近的DNA链互补配对。A.反向PCR应选择引物1和引物4进行PCR扩增B.设计的引物不宜过短,否则扩增的特异性会下降C.PCR产物是包含已知序列和所有未知序列的环状DNA分子D.整个过程需用到限制酶、DNA连接酶和耐高温的DNA聚合酶C解析DNA子链合成的方向为5端到3端,因此要通过已知序列设计引物对未知序列进行扩增应选择引物1和引物4进行PCR扩增,A项正确。设计的引物不宜过短,否则扩增的特异性会下降,B项正确。PCR产物是包含所有已知序列和未知序列的链状DNA分子,扩增产物还需要经过限制酶切割后再用DNA连接酶连接才能形成环状,C项错误。整个过程需用到限制酶、DNA连接酶和耐高温的DNA聚合酶,D项正确。三、不对称PCR正常的PCR反应需要一对相对配置的引物同时扩增的两条模板链。如果只加入一条引物,那么将会只扩增一条模板链。像这种加入一条引物扩增的PCR反应叫作不对称PCR。【例4】(2025·江苏扬州模拟)不对称PCR是一种常见的单链DNA探针制备方法,其原理是反应体系中加入一对数量不相等的引物,数量较少的为限制性引物,数量较多的为非限制性引物。假设体系中模板DNA数量为a,在PCR反应的早期10个循环中,扩增产物是双链DNA,限制性引物耗尽,非限制性引物继续引导合成大量目标DNA单链。下列说法正确的是()A.若B链为所需的DNA探针,则非限制性引物应选用引物ⅣB.两种引物与模板链结合时,需将温度控制在72℃左右C.如果总共进行25次循环,最终获得的单链DNA探针数为15×210a个D.因为双链DNA和单链DNA的长度相同,不能通过电泳方法将其分离C解析由于DNA聚合酶只能从3端延伸DNA链,引物Ⅱ和Ⅲ不能作为扩增探针序列的引物,据题干信息可知,数量较多的非限制性引物将引导合成大量目标DNA单链,若B链为所需的DNA分子探针,即目标DNA单链,则非限制性引物应选用引物Ⅰ,A项错误。两种引物与模板链结合即复性过程,该过程中温度下降到50℃左右,两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合,B项错误。假设B链为目标DNA单链,如果体系中原模板DNA的数量为a,早期10个循环产物双链DNA分子的数量为210×a个,其中有A链210×a个,以A链为模板,利用引物又进行了15次循环,每次循环生成的都是B链,不改变A链的数目,即每次后期循环开始时的模板链A链的数目都是210×a个,15次循环每次生成B链也是210×a个,故最终获得的单链DNA探针数共为15×210×a个,C项正确。单链DNA和双链DNA的相对分子质量不同,电泳可以将其分离,D项错误。【归纳拓展】不对称PCR主要只扩增一条模板链,实际操作时,为了增加模板量,也可以加入一对引物,只是两条引物在浓度上应存在差异。如此题经若干次循环后,低浓度的引物(限制性引物)被消耗尽,以后的循环只产生高浓度引物(非限制性引物)的延伸产物。此技术可制备单链DNA片段用于序列分析或核酸杂交的探针。四、实时荧光定量PCR实时荧光定量PCR主要是通过荧光PCR连续监测荧光信号出现的先后顺序以及信号强弱的变化,实时分析目的基因的初始量,该技术的发明实现了PCR从定性到定量的飞跃。RT表示逆转录。在RT-PCR中,通过逆转录酶将RNA转化为cDNA,然后通过聚合酶链式反应扩增cDNA。【例5】(2025·江西模拟预测)实时荧光定量PCR(qPCR)利用荧光信号变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化,其灵敏度高、特异性好,是目前检测微小残留病变的常用方法。请回答下列有关问题。图1(1)Taqman探针是qPCR中一种常用的探针,其5端连接荧光基团(F),3端连接淬灭基团(Q)。当探针完整时,两个基团距离很近,F发出的荧光信号被Q吸收而不能被检测到。在qPCR过程中,当TaqDNA聚合酶遇到探针时,探针会水解,F和Q两个基团分离,F发出的荧光信号被相应仪器检测到,即可对PCR进行实时分析。具体过程如图1所示。①qPCR除需要Taqman探针外,还需要模板DNA、TaqDNA聚合酶、和dNTP(N代表A、T、G、C)等,每个循环需要经历、、延伸三个阶段,其中延伸阶段是从引物的(填“3”或“5”)端开始的。?②在qPCR过程中,TaqDNA聚合酶的两个作用是?