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武汉尚恩生物流式抗体实验全攻略：从表面到胞内

流式抗体指可以应用于流式实验的抗体，与ELISA、WB、IF等实验抗体相比，通常不需要过于复杂的样本处理和实验步骤，同时检测的是活细胞或者固定细胞，可以获得单细胞多参数的定量结果。流式抗体又分为未标记的和荧光标记的，未标记的流式抗体需要配合相应二抗使用，荧光标记的流式抗体自带荧光不需要二抗。尚恩生物提供的流式抗体是经过荧光标记，可以直接与处理后的样本进行孵育，然后通过流式细胞仪检测，若需未标记的流式抗体，可以联系销售人员咨询。

流式抗体染色流程

一、细胞表面染色操作流程

1细胞计数

将培养好的细胞收集于15mL离心管并计数；若为贴壁细胞，需要先用胰酶消化细胞，300g离心5min，去上清。

2制备单细胞悬液

将收集的细胞用1mL预冷0.5%BSA/PBS溶液重悬，300g离心5min，去上清，重复2次；用0.5%BSA/PBS溶液重悬细胞至浓度1x107个细胞/mL，取100μL细胞悬液置于流式管内。

3（可选）阻断Fc受体

可用抗体同源血清全IgG抗体与细胞充分混匀，室温孵育10-20min。

4一抗孵育

每管加入稀释后的一抗溶液100μL，2-8℃反应30min，孵育期间每隔10min晃动一下反应管，使细胞和抗体充分反应。若为直标抗体，需要避光反应，跳到步骤7。抗体稀释液为0.5%BSA/PBS溶液。

5洗涤

300g离心5min，去上清后加入200μL0.5%BSA/PBS溶液重悬，离心去上清，重复两遍。

6二抗孵育

对于非荧光染料直标抗体，加入100μL荧光二抗重悬，避光2-8℃反应30min，孵育期间每隔10min晃动一下反应管。

7洗涤

300g离心5min，去上清后加入200μL0.5%BSA/PBS溶液重悬，离心去上清，重复两遍。

8上机分析

用200μL0.5%BSA/PBS溶液重悬细胞，4℃保存，上机分析。

二、细胞胞内染色操作流程

1细胞计数

将培养好的细胞收集于15mL离心管并计数；若为贴壁细胞，需要先用胰酶消化细胞，300g离心5min，去上清。

2制作单细胞悬液

将收集的细胞用1mL0.5%BSA/PBS溶液重悬，300g离心5min，去上清，重复2次；用0.5%BSA/PBS溶液重悬细胞至浓度1x107个细胞/mL，取100μL细胞悬液置于流式管内，300g离心5min去上清。

3固定

每管加入100μL细胞固定剂重悬细胞，2-8°孵育20min。固定剂可用4%多聚甲醛。

4洗涤

600g离心5min，去上清后加入200μL0.5%BSA/PBS溶液重悬，离心去上清，重复两遍。

5通透

每管加入100μL细胞通透剂重悬细胞，室温孵育20min。通透剂可用0.5%BSA/PBS（0.3%TritonX-100）

6洗涤

600g离心5min，去上清后加入200μL0.5%BSA/PBS溶液重悬，离心去上清，重复两遍。

7（可选）阻断Fc受体

用抗体同源血清全IgG抗体与细胞充分混匀，室温10-20min。

8一抗孵育

每管加入稀释后的一抗溶液100μL，2-8℃反应30min，孵育期间每隔10min晃动一下反应管，使细胞和抗体充分反应。若为直标抗体，需要避光反应，跳到步骤11。抗体稀释液为0.5%BSA/PBS溶液。

9洗涤

600g离心5min，去上清后加入200μL0.5%BSA/PBS溶液重悬，离心去上清，重复两遍。

10二抗孵育

对于非荧光染料直标抗体，加入100μL荧光二抗重悬，避光2-8℃反应30min，孵育期间每隔10min晃动一下反应管。对于直标抗体直接跳到步骤11。

11洗涤

600g离心5min，去上清后加入200μL0.5%BSA/PBS溶液重悬，离心去上清，重复两遍。

12上机分析

用200μL0.5%BSA/PBS溶液重悬细胞，4℃保存，上机分析。

注：实验建议设置空白对照，同型对照，空白对照不加一抗，同型对照将一抗替换为同型抗体。