细胞的分离操作流程.docxVIP

细胞的分离操作是细胞生物学、医学研究和临床诊断中的基础技术，通常分为原代细胞分离（从组织中直接分离）和传代细胞分离（从培养的细胞中分离）。以下是常见的操作流程及注意事项：

一、原代细胞分离（以组织为例）

1.实验前准备

试剂与材料：无菌PBS缓冲液、消化酶（如胰酶、胶原酶等）、培养基（含血清）、离心管、培养皿、细胞筛（70-100μm）、手术器械（剪刀、镊子）、冰盒。

仪器：超净工作台、离心机、水浴锅/恒温箱、显微镜。

2.操作流程

组织取材：

获取新鲜组织样本（如肝脏、肿瘤组织等），置于预冷的无菌PBS或培养基中。

去除多余脂肪、结缔组织，用PBS清洗3次以去除血液和杂质。

组织剪碎：

将组织切成1-3mm3的小块，用PBS漂洗至液体澄清。

组织消化：

机械法：适用于较软组织（如脑组织），通过研磨或反复吹打分散细胞。

酶消化法（常用）：

加入适量消化酶（如0.25%胰酶或胶原酶IV），37℃孵育15-60分钟（时间依组织类型调整）。

每隔10分钟轻摇或吹打，促进组织解离。

终止消化：加入含血清的培养基（血清可中和胰酶）。

细胞悬液处理：

用细胞筛过滤，去除未消化的组织块。

离心（1000rpm，5分钟），弃上清。

用培养基重悬细胞，计数并调整细胞密度。

细胞接种：

将细胞悬液接种至培养瓶/皿中，置于37℃、5%CO?培养箱中培养。

二、传代细胞分离（贴壁细胞为例）

1.实验前准备

试剂：0.25%胰酶-EDTA、完全培养基（含血清）、PBS。

仪器：离心机、培养箱。

2.操作流程

弃旧培养基：

吸除培养瓶中的旧培养基，用PBS轻柔冲洗2次，去除残留血清（血清会抑制胰酶活性）。

胰酶消化：

加入适量胰酶-EDTA（覆盖瓶底），37℃孵育1-5分钟（观察细胞回缩、间隙变大）。

轻拍培养瓶，使细胞脱落。若未完全脱落，可延长消化时间（避免过度消化）。

终止消化：

加入等体积完全培养基（含血清），吹打细胞至悬液状态。

离心与重悬：

转移至离心管，1000rpm离心5分钟，弃上清。

用新鲜培养基重悬细胞，计数后按比例接种至新培养瓶。

三、注意事项

无菌操作：全程在超净台中进行，避免污染。

细胞活性：消化时间过长或离心速度过高可能损伤细胞，需优化条件。

酶的选择：

胶原酶：适用于结缔组织（如肝脏、肿瘤）。

胰酶：适用于上皮细胞或贴壁细胞。

DNA酶：若样本粘稠（如富含DNA），可添加少量DNase。

细胞计数：使用台盼蓝染色法评估细胞存活率（活细胞拒染）。

个性化调整：不同组织或细胞系对消化条件敏感度不同，需预实验优化。

四、应用场景

原代细胞分离：用于疾病模型构建、药物筛选、干细胞研究等。

传代细胞分离：用于细胞扩增、冻存或实验分组。