常规分子生物学操作要点.pptVIP

基于同源序列的克隆技术已克隆的一些基因（转录因子、蛋白激酶类的基因）在氨基酸水平上表现出一定程度的相似性，在一些区段高度保守，这些保守的结构区不仅有助于基因的分离及作用机理的理解，而且也为基因克隆提供了一条快捷途径。这就是基于同源序列的候选基因法（homology-basedcandidategenemethod）。其基本思路是：根据已知克隆的保守区设计简并引物，对基因组DNA进行扩增，得到该基因的类似序列，检测这些序列与性状共分离情况。如果这些序列与性状紧密相关或带有该基因功能结构区序列，则可用于其作为探针筛选基因组文库，获得候选基因；或者通过扩增末端的方法克隆全长基因。第56页，共80页，星期日，2025年，2月5日SequenceanalysisofgeneGsCBRLK——ByPh.D.LiangYang第57页，共80页，星期日，2025年，2月5日SequenceanalysisofgeneGsCBRLK——ByPh.D.LiangYangThehydrophilicresidueswereillustratedascircles,hydrophobicresiduesasdiamonds,potentiallynegativelychargedastriangles,andpotentiallypositivelychargedaspentagons.Hydrophobicityiscolorcodedwithgreen(themosthydrophobicresidue)andyellow(zerohydrophobicity)withtheamountofgreendecreasingproportionallytothehydrophobicity.Hydrophilicresiduesarecodedredwithpureredbeingthemosthydrophilic(uncharged)residue,andtheamountofreddecreasesproportionallytothehydrophilicity.ThepotentiallychargedresiduesarecodedlightblueFig.2AhelicalwheelprojectionpredictionofCaMBDinproteinGsCBRLK第58页，共80页，星期日，2025年，2月5日目前，这种方法已引起国内外学者的广泛关注。在抗病方面已经应用很广泛，已在大豆，马铃薯、水稻、小麦、大麦、番茄和玉米中分离到了许多于已知抗病基因同源的DNA片段。在植物渗透胁迫相关基因的克隆方面，Urao等利用这一方法，根据蛋白激酶保守功能结构区和CDPK特有的E-F手性结构区序列设计简并引物，从拟南芥中分离了编码CDPK的2个cDNA克隆(cATCDPK1和cATCDPK2)，并通过功能分析验证了这两个基因在植物抗渗透胁迫中的作用。这些研究证明了同源性克隆技术分离植物抗逆性基因的可行性。第59页，共80页，星期日，2025年，2月5日基因克隆的一种方法－RACERACE的基本概念不同厂家RACE试剂盒的介绍RACE技术的关键环节存在的问题及解决办法第60页，共80页，星期日，2025年，2月5日RACE的基本概念cDNA末端快速扩增(rapidamplificationofcDNAends,RACE)技术是基于PCR技术由已知的部分cDNA序列来获得完整cDNA序列的一种方法，为Frohman在1985年首次报道。3’RACE和5’RACE介绍一下不同公司生产的RACE试剂盒的特点第61页，共80页，星期日，2025年，2月5日3’RACE原理示意图第62页，共80页，星期日，2025年，2月5日原理电泳及迁移率核苷酸链多聚阴离子在生理条件下，核酸分子的糖一磷酸骨架中的磷酸基团，是呈离子化状态的。相同分子量的双链DNA几乎具有等量净电荷无反应活性的稳定的介质降低了对流运动，故电泳的迁移率又是同分子的摩擦系数成反比的。已知摩擦系数是分子的大小、极性及介质粘度的函数，分子大小的不同、构型或形状的差异，所带的净电荷的多寡，便彼此分离开来。第24页，共80页，星期日，2025年，2月5日琼脂糖凝胶电泳琼脂糖为线性多糖聚合物，红色海藻产物琼脂中提取而来。琼脂糖溶液加热到沸点后冷却凝固，密度由浓度决定的。分辨能力同凝胶的类型和浓