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基于胞浆蛋白增强信号的类花青素荧光分子探针：合成、性能与应用研究

一、绪论

1.1小分子荧光探针概述

1.1.1小分子荧光探针的结构

小分子荧光探针一般由荧光团、连接臂和识别基团三部分构成。荧光团是荧光探针的核心部分，其具备共轭π电子体系，能吸收特定波长的光并被激发至激发态，随后返回基态时发射出荧光，常见的荧光团有香豆素、荧光素、罗丹明、花菁、氟硼二吡咯（BODIPY）等，不同的荧光团发射波长、量子产率、光稳定性等光物理性质各异，决定了探针的荧光特性。

连接臂在荧光团和识别基团之间起连接作用，其长度、柔性以及电子性质会影响荧光团与识别基团之间的相互作用，进而影响探针的选择性和灵敏度。例如，合适长度的连接臂可保证识别基团与目标物结合时，荧光团的荧光性质能有效响应，过长或过短都可能导致信号传递受阻。

识别基团负责特异性地识别目标分析物，与目标物通过配位作用、氢键、静电作用、疏水作用等相互作用结合，从而引发荧光团周围化学环境改变，导致荧光信号变化。比如，用于检测金属离子的探针，其识别基团常含有能与金属离子配位的原子或基团，如氮、氧、硫原子以及氨基、羧基、巯基等。

1.1.2小分子荧光探针的响应机理

光诱导电子转移（PET）：在光诱导电子转移过程中，当识别基团未与被分析物结合时，荧光基团受光激发后，处于激发态的荧光基团与识别基团之间会发生电子转移，使得激发态的电子无法通过辐射跃迁回到基态，荧光淬灭。而当识别基团与被分析物特异性结合后，PET过程受到阻碍，荧光基团的荧光得以恢复。以检测锌离子的小分子荧光探针为例，未结合锌离子时，识别基团上的电子给体可将电子转移至荧光团的最低未占分子轨道（LUMO），使荧光淬灭；结合锌离子后，识别基团与锌离子配位，电子转移路径改变，PET过程受阻，荧光恢复，通过荧光强度的变化实现对锌离子的检测。

荧光共振能量转移（FRET）：FRET是指在两个距离较近（一般小于10nm）的荧光基团之间，当供体荧光基团的发射光谱与受体荧光基团的吸收光谱有一定程度重叠，且两个荧光基团的偶极矩相互平行时，供体被激发后，能量可以非辐射的方式转移给受体，导致供体荧光强度减弱，受体荧光强度增强。如在生物分子相互作用研究中，可将供体和受体荧光基团分别标记在两种相互作用的生物分子上，当这两种生物分子相互靠近时，发生FRET现象，通过检测供体和受体荧光强度的变化，可研究生物分子间的相互作用。

分子内电荷转移（ICT）：分子内电荷转移机理基于荧光团分子内电子给体（D）和电子受体（A）之间的电荷转移。当荧光团受到光激发后，电子从电子给体转移至电子受体，形成分子内电荷转移态。当识别基团与被分析物结合时，会改变荧光团分子内电子给体和电子受体之间的电子云分布，从而影响ICT过程，导致荧光光谱的变化，包括荧光强度、波长等。例如，某些用于检测酸碱度的荧光探针，在不同pH环境下，识别基团的质子化或去质子化状态改变，影响荧光团的ICT过程，使荧光光谱发生变化，实现对pH的检测。

在类花青素荧光分子探针中，这些响应机理都有应用的可能性。若设计用于检测特定生物分子的类花青素荧光探针，可利用PET机理，通过合理设计识别基团与生物分子结合前后对荧光团电子转移的影响，实现荧光信号变化以检测生物分子；基于FRET机理，可将类花青素作为供体或受体，与合适的另一荧光基团配合，用于研究生物分子间的距离变化或相互作用；运用ICT机理，可通过修饰类花青素结构引入电子给体和受体，结合识别基团与目标物作用时对电子云分布的影响，设计对目标物响应的荧光探针。

1.1.3小分子荧光探针的信号输出模式

荧光强度变化：这是最常见的信号输出模式。当探针与目标物相互作用后，荧光团的荧光强度会增强（turn-on）或减弱（turn-off）。如基于PET机理的荧光探针，与目标物结合后PET过程受阻，荧光强度增强；而有些探针与目标物结合后，会导致荧光团的荧光淬灭，强度减弱。荧光强度变化模式的优点是检测简单直接，仪器设备要求相对较低，可通过荧光分光光度计等常见仪器进行检测。但其局限性在于易受环境因素影响，如溶液浓度、温度、pH值、杂质等都可能对荧光强度产生干扰，导致检测结果不准确。

荧光波长位移：探针与目标物作用后，荧光发射波长发生红移（向长波长方向移动）或蓝移（向短波长方向移动）。这种信号输出模式基于分子结构变化引起的能级改变。例如，某些荧光探针与金属离子结合后，分子内共轭体系改变，导致荧光波长发生位移。其优势在于可减少背景荧光干扰，提高检测的选择性。因为不同物质的荧光波长位移特性不同，可通过检测波长变化来特异性识别目标物。缺点是对检测仪器的波长分辨率要求较高，且波长位移的幅