基于核酸适配体的细菌内毒素检测新策略：液相与固 - 液相方法的深度解析.docxVIP

基于核酸适配体的细菌内毒素检测新策略：液相与固-液相方法的深度解析

一、引言

1.1研究背景与意义

细菌内毒素，作为革兰氏阴性菌细胞壁的组成部分，本质为脂多糖（LPS）。其结构复杂，由O-特异性多糖、核心多糖和脂质A构成，其中脂质A是毒性中心。当细菌死亡、自溶或受外界因素作用细胞壁被破坏时，内毒素释放。

细菌内毒素对人体健康危害巨大。进入人体后，它能激活免疫系统，引发发热反应，严重时导致高热甚至毒性反应。单核细胞、巨噬细胞等免疫细胞识别内毒素后，释放白细胞介素-1（IL-1）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等细胞因子，作用于下丘脑体温调节中枢，使体温调定点上移，进而发热。过度发热使人体代谢加快，消耗大量能量和营养物质，导致身体虚弱，还可能损害神经系统、心血管系统，引发抽搐、心律失常等严重后果，且发热持续时间长，难以用常规退热药物完全控制。此外，内毒素过量会引起低血压、组织缺氧等休克症状，导致免疫系统紊乱，长期或过量暴露可引发炎症和其他免疫相关疾病，直接损伤肝脏、肾脏等多种器官，导致功能不全或衰竭，影响凝血系统，造成出血倾向或凝血障碍，引发腹泻、恶心、呕吐等消化系统症状，长期暴露还与慢性支气管炎、慢性阻塞性肺疾病等慢性疾病的发生有关。

在医疗领域，细菌内毒素的检测至关重要。药品、医疗器械中的细菌内毒素若进入人体，可能引发严重不良反应，威胁患者生命健康。目前临床上内毒素的检测方法主要有鲎变形细胞溶解物（LAL）试验、动态浊度法、与重组因子C相关的检测方法等。其中，鲎变形细胞溶解物试验最为常用，该方法虽灵敏度和特异性较高，但对LPS的污染极为敏感，对所用器皿的消毒要求高，且活性易受某些金属离子、抗生素、氨基酸、糖类、血浆蛋白等影响，检测品种有限。其他方法也各自存在局限性，如检测结果差异大、受样本中物质干扰、检测试剂批次差异影响结果等。

基于核酸适配体的检测方法研究具有重要意义。核酸适配体是通过指数富集配体的系统进化技术（SELEX）筛选得到的，能特异结合靶物质的单链寡聚核苷酸（ssDNA或ssRNA）。其与传统抗体相比，具有更高的亲和力与特异性，无免疫原性，能够化学合成，成本低，可进行标记，稳定性好，易于保存等优点，有望克服现有细菌内毒素检测方法的局限性，为细菌内毒素的检测提供更准确、灵敏、便捷的新方法，在临床诊断、药品质量控制等方面发挥重要作用，对保障人体健康具有深远影响。

1.2核酸适配体概述

核酸适配体（Aptamer）是一段DNA（脱氧核糖核酸）、RNA（核糖核酸）序列、XNA（核酸类似物）或肽，通常是利用体外筛选技术——指数富集的配体系统进化技术（Systematicevolutionofligandsbyexponentialenrichment，SELEX），从核酸分子文库中得到的寡核苷酸片段。

SELEX技术的基本过程如下：首先构建一个包含大量随机序列的核酸文库，其成员数量可多达10^15个不同的核酸序列。然后，将这个文库与靶分子进行孵育，使核酸分子与靶分子充分接触。在此过程中，文库中的核酸分子会凭借自身的结构特点与靶分子发生特异性结合。通过一系列的分离手段，如亲和层析、过滤、电泳等，将与靶分子结合的核酸分子分离出来。接着，对这些结合的核酸分子进行PCR扩增，以获得足够数量的拷贝。经过多轮这样的筛选、分离和扩增过程，与靶分子亲和力高、特异性强的核酸适配体在文库中的比例逐渐增加，最终从文库中筛选得到能与靶分子高度特异性结合的核酸适配体。

与传统抗体相比，核酸适配体在检测中具有显著优势。在稳定性方面，蛋白质作为抗体的主要成分，易受pH、温度等环境因素影响而变性，导致其活性丧失。而核酸适配体由DNA或RNA构成（主要是DNA），化学性质相对稳定，能够在较为宽泛的环境条件下保持其结构和功能的完整性，可在不同的温度、pH值条件下储存和使用，不易因环境变化而失去与靶标结合的能力。在合成难度与成本上，抗体的制备通常需要通过免疫动物，经过复杂的免疫反应和后续的纯化过程，周期长且成本高。核酸适配体则可以通过化学合成的方法大量制备，合成过程相对简单，成本较低，能够快速获得大量高纯度的核酸适配体，满足不同检测需求。从特异性与亲和力角度，核酸适配体经SELEX筛选富集后，可以拥有与抗原-抗体反应相匹敌的灵敏度，能够高度特异性地识别靶分子，对靶分子的微小结构差异都能准确区分，实现精准检测。

1.3研究目标与内容

本研究旨在建立并优化基于核酸适配体的细菌内毒素液相和固-液相检测方法，并对其性能进行全面评估。

在建立检测方法方面，通过SELEX技术筛选出与细菌内毒素具有高亲和力和高特异性的核酸适配体。详细研究核酸适配体与细菌内毒素的结合条件，