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瑞氏木霉N-糖基化途径人源化改造：策略、实践与展望

一、引言

1.1研究背景

在真核生物中，N-糖基化修饰是一种极为普遍且重要的蛋白质翻译后修饰方式。约90%的糖蛋白会发生N-糖基化，从内质网起始，在寡糖基转移酶的催化下，将N-聚糖转移至蛋白质Nglyco-X-S/T（X可以是除Pro外的任一必需氨基酸）基序的天冬酰胺Nglyco残基上，随后进入高尔基体经历进一步的加工修饰。这一修饰过程对蛋白质的折叠、稳定性、质量控制、分类和定位等有着深远的影响，进而广泛参与到细胞分化、生长、发育和细胞间通讯等多种关键生物学过程中。

在药用蛋白生产领域，N-糖基化修饰的重要性愈发凸显。它不仅直接关系到药用蛋白的功能，还与蛋白的安全性紧密相连。以促红细胞生成素（EPO）为例，其作为一种重要的药用糖蛋白，主要由肾脏细胞合成和分泌，在临床上被广泛应用于治疗各种疾病引发的贫血症。EPO的N-糖基化修饰对其生物活性起着决定性作用，合适的糖基化修饰能够确保EPO与受体的有效结合，进而促进骨髓红细胞的生成和释放。若EPO的N-糖基化修饰出现异常，可能导致其无法正常发挥生物学功能，影响治疗效果。此外，N-糖基化修饰还在一定程度上影响着药用蛋白的免疫原性。若糖基化修饰不符合人体生理需求，可能引发机体的免疫反应，导致药物的安全性受到威胁。因此，对于药用蛋白而言，实现精准且符合人体生理需求的N-糖基化修饰至关重要。

目前，常用的真核来源药用蛋白表达系统各有优劣。原核生物表达系统由于缺乏必要的蛋白质糖基化修饰机制，难以满足药用蛋白对糖基化的要求；哺乳动物细胞表达系统虽能够生产人源化糖蛋白，但其存在重组蛋白产量低、培养时间长以及成本昂贵等诸多问题，限制了其大规模应用。而酵母和丝状真菌作为工业发酵常用的真核微生物，具有操作简便、发酵周期短和成本低廉等显著优势。其中，丝状真菌的寡聚糖加工系统和N-糖基化类型相较于酵母，更接近于人的加工系统和人源糖蛋白的寡聚糖类型，因此受到了广泛关注。

瑞氏木霉（Trichodermareesei）作为一种重要的丝状真菌，具有典型的真核蛋白修饰特性和理想的蛋白分泌能力，某些菌株的胞外酶产量可达20-40g/L，在工业生产和基因工程领域展现出巨大的应用潜力，已被广泛用作基因工程宿主菌来生产外源真核蛋白。然而，瑞氏木霉与哺乳动物之间在糖基化修饰形式上仍存在一定差异。哺乳动物N-聚糖的经典加工途径可产生复合型N-聚糖，而瑞氏木霉的N-聚糖通常为寡甘露糖型。这种差异使得利用瑞氏木霉为宿主生产的人源重组糖蛋白在临床理化性质和药理作用方面受到一定限制。瑞氏木霉产生的人源重组糖蛋白可能因糖基化修饰的差异，导致其在体内的稳定性、半衰期以及与靶细胞的结合能力等方面与天然人源糖蛋白存在差异，进而影响药物的疗效和安全性。因此，对瑞氏木霉N-糖基化途径进行人源化改造具有重要的现实意义和应用价值。

1.2研究目的和意义

本研究旨在通过对瑞氏木霉N-糖基化途径进行人源化改造的初步实验研究，实现以下目标：深入剖析瑞氏木霉N-糖基化途径的关键酶和底物特征，精准确定改造方向和对象；通过基因工程技术，克隆并改造瑞氏木霉N-糖基化途径关键酶和底物基因，使其能够在瑞氏木霉中按照人源糖基化途径模式进行表达；对改造后的底物进行全面的糖基化修饰分析和鉴定，明确糖基化位点和糖基化模式，初步解析糖链结构。

从学术研究角度来看，目前有关糖基化修饰的研究主要集中于人源蛋白的表达和糖基化分析，而对真菌糖基化途径的研究相对匮乏。本研究致力于对瑞氏木霉N-糖基化途径的人源化改造，这将有助于扩充真菌糖基化途径的研究领域，为深入探究糖基化修饰的生物学意义提供新的视角和实验依据，丰富和完善糖生物学的理论体系。

在实际应用方面，随着基因工程技术和现代医学的迅猛发展，药用人源或动物来源的重组蛋白质的生产对宿主表达系统的糖基化修饰提出了更高要求。通过对瑞氏木霉N-糖基化途径的人源化改造，有望获得能够产生与人或哺乳动物糖基化形式相近的工程菌株。这将为药用糖蛋白的生产开辟新的途径，有助于提高药用糖蛋白的活性和稳定性，降低生产成本，满足临床对高质量药用糖蛋白的迫切需求，推动生物制药产业的发展，具有重要的经济价值和社会意义。

二、瑞氏木霉N-糖基化途径解析

2.1瑞氏木霉简介

瑞氏木霉（Trichodermareesei）作为一种广泛存在于自然界的丝状真菌，在工业生产领域展现出独特的优势。它属于半知菌亚门丝孢纲丝孢目木霉属，具有典型的丝状真菌形态特征，其菌丝体呈丝状，有隔且分支，能形成复杂的菌丝网络。瑞氏木霉生长迅速，在适宜的培养条件下，如以纤维素、淀粉