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多重PCR技术构建：GJB2基因致聋缺失突变同步检测体系及价值探究

一、引言

1.1研究背景与意义

1.1.1耳聋疾病现状

听力损失作为全球范围内常见的健康问题之一，严重影响着患者的生活质量与社会融入。据世界卫生组织（WHO）统计，全球约有3.6亿人患有不同程度的耳聋，占全球总人口的5%。在我国，听力障碍残疾人数量高达九千多万，位居各类残疾之首。新生儿先天性耳聋的发病率约为1‰-3‰，且每年新增聋儿2-4万。随着人口老龄化进程的加快，老年性耳聋的患病率也在不断上升，在65岁以上的老年人中，听力损失的发生率超过30%。

耳聋不仅给患者个人带来沉重的心理负担和生活不便，还对家庭和社会造成了巨大的经济压力。由于听力障碍，患者在语言学习、社交沟通、教育就业等方面面临诸多困难，严重限制了其个人发展和社会参与度。同时，为了治疗和康复听力损失，家庭和社会需要投入大量的医疗资源和经济成本，包括助听器、人工耳蜗等听力辅助设备的购置，以及长期的康复训练和医疗服务费用。

1.1.2GJB2基因与耳聋的关联

GJB2基因，全称缝隙连接蛋白26基因（gapjunctionprotein,beta-2），定位于人类染色体13q11-q12，编码的缝隙连接蛋白26（Connexin26，Cx26）是构成细胞间缝隙连接的重要组成部分。缝隙连接广泛存在于人体多种组织细胞中，其主要功能是介导相邻细胞间小分子物质（如离子、代谢产物等）的直接交换和电信号传导，对于维持细胞间的信息交流、协调组织器官的正常生理功能起着关键作用。

大量研究表明，GJB2基因的突变与遗传性非综合征型耳聋（non-syndromichearingimpairment，NSHI）密切相关，是导致先天性耳聋的主要原因之一。在常染色体隐性遗传的NSHI患者中，约有50%是由GJB2基因突变引起。GJB2基因突变具有明显的种族和地域差异，在中国人群中，GJB2基因突变导致的耳聋约占遗传性耳聋的21%，其中常见的突变类型包括235delC、299-300delAT和176del16bp等。这些突变可导致Cx26蛋白结构和功能异常，破坏细胞间缝隙连接的正常形成和功能，进而影响内耳毛细胞的正常生理功能，导致听力损失。

1.1.3同步检测方法的重要性

传统的GJB2基因突变检测方法主要包括聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性分析（PCR-RFLP）、测序技术等。PCR-RFLP方法操作相对简单、成本较低，但检测通量有限，只能针对已知的突变位点进行检测，对于未知突变的筛查能力不足；测序技术虽然能够准确检测出所有的基因突变类型，但存在检测周期长、成本高、技术要求复杂等缺点，难以在临床大规模推广应用。

因此，建立一种高效、准确、快速且成本低廉的GJB2基因三个致聋缺失突变同步检测方法具有重要的临床意义和应用价值。该方法能够实现对多个常见突变位点的同时检测，提高检测效率和准确性，有助于早期明确耳聋病因，为临床诊断、遗传咨询和个性化治疗提供可靠依据。同时，对于预防遗传性耳聋的发生、降低耳聋发病率、提高人口素质也具有积极的推动作用。通过对高危人群进行基因筛查，可及时发现携带突变基因的个体，采取有效的干预措施，如避免使用耳毒性药物、加强听力监测等，从而降低耳聋的发生风险。

1.2国内外研究现状

在GJB2基因致聋突变检测方法的研究方面，国内外学者进行了大量的探索和实践。早期，主要采用PCR-RFLP、等位基因特异性PCR（AS-PCR）等技术对GJB2基因常见突变位点进行检测。这些方法虽然操作相对简便，但存在检测通量低、易出现假阳性或假阴性结果等问题。

随着分子生物学技术的不断发展，荧光定量PCR、基因芯片、高通量测序等新型检测技术逐渐应用于GJB2基因突变检测领域。荧光定量PCR技术具有灵敏度高、特异性强、检测速度快等优点，能够实现对突变基因的定量分析，但一次只能检测少数几个突变位点，难以满足临床对多个突变位点同时检测的需求。基因芯片技术则可同时对多个基因位点进行平行检测，具有高通量、自动化程度高的特点，但芯片制备成本较高，检测结果的准确性易受杂交条件等因素影响。高通量测序技术能够全面、准确地检测出基因的所有突变类型，包括未知突变，但设备昂贵、数据分析复杂、检测成本高昂，限制了其在临床常规检测中的广泛应用。

近年来，一些新型的分子检测技术，如基于CRISPR/Cas系统的基因编辑技术、数字PCR技术等，也开始被尝试应用于GJB2基因突变检测研究。CRISPR/Cas系统具有高度的特异性和可编程性，能够精确识别并切割目标DNA序列，为