基于酵母三杂交系统构建端粒酶抑制剂高通量筛选模型：方法、验证与应用.docxVIP

基于酵母三杂交系统构建端粒酶抑制剂高通量筛选模型：方法、验证与应用

一、引言

1.1研究背景

端粒酶作为一种维持染色体稳定性和生命活力的关键酶，在染色体末端的端粒发挥作用。它能够识别染色体末端特定的序列（TTAGGG），并在其上加入端粒序列，从而保护染色体末端免受降解和损伤。端粒酶的活性与癌症、衰老等疾病的发生发展密切相关，因此，开发端粒酶抑制剂成为当下研究的热点之一。

在正常细胞中，随着细胞的不断分裂，端粒会逐渐缩短。当端粒缩短到一定程度时，细胞就会停止分裂，进入衰老或凋亡状态。而在癌细胞中，端粒酶的活性通常异常升高，使得癌细胞能够不断维持端粒的长度，进而获得无限增殖的能力。这种特性使得癌细胞可以逃避正常的细胞衰老和死亡机制，持续分裂和生长，最终导致肿瘤的形成和发展。研究表明，在大多数人类癌症中，如乳腺癌、结肠癌、肺癌、卵巢癌等，都检测到了端粒酶的高表达。这不仅为癌症的诊断提供了潜在的生物标志物，也使得端粒酶成为了极具潜力的抗癌药物靶点。

端粒酶与衰老也有着紧密的联系。随着年龄的增长，人体细胞中的端粒酶活性逐渐降低，端粒长度逐渐缩短，这被认为是导致细胞衰老和机体老化的重要原因之一。端粒缩短会引发一系列细胞功能的衰退，包括细胞增殖能力下降、代谢功能紊乱、抗氧化能力减弱等，最终导致组织和器官的功能衰退，表现出各种衰老相关的症状和疾病，如心血管疾病、神经退行性疾病等。因此，通过调节端粒酶的活性，有望延缓细胞衰老和机体老化的进程，为衰老相关疾病的治疗提供新的策略。

鉴于端粒酶在癌症和衰老等疾病中的关键作用，开发高效、特异性的端粒酶抑制剂具有重要的意义。端粒酶抑制剂可以通过抑制端粒酶的活性，阻止癌细胞中端粒的延长，从而诱导癌细胞衰老、凋亡，达到治疗癌症的目的。对于衰老相关疾病，端粒酶抑制剂可能通过调节端粒酶活性，维持端粒长度，延缓细胞衰老，改善组织和器官的功能。目前，虽然已经有一些端粒酶抑制剂进入临床试验阶段，但大多数仍存在疗效不理想、副作用大等问题，因此，寻找新型、高效、低毒的端粒酶抑制剂仍然是医学和生物学领域的重要研究方向。

1.2传统筛选方法的局限

传统的端粒酶抑制剂筛选方法包括木犀草素（TRAP）酶活性测定、端粒酶吸附法、细胞实验等。然而，这些方法存在诸多问题，限制了其在端粒酶抑制剂筛选中的广泛应用。

木犀草素（TRAP）酶活性测定是一种较为常用的传统方法，其原理是利用端粒酶能够在体外延伸特定引物的特性，通过聚合酶链式反应（PCR）扩增延伸产物，再通过聚丙烯酰胺凝胶电泳或荧光检测等方法来检测端粒酶的活性。但该方法操作复杂，需要经过多个步骤，包括细胞裂解、引物延伸、PCR扩增、产物检测等，每个步骤都需要严格控制实验条件，稍有不慎就会影响实验结果的准确性。TRAP法需要使用放射性同位素或荧光标记的引物，这不仅增加了实验成本和操作风险，还对实验人员的安全和环境造成潜在威胁。而且，该方法易受PCR派生产物的影响，导致结果的假阳性或假阴性增加，稳定性较差。

端粒酶吸附法是通过将端粒酶特异性地吸附到固相载体上，然后加入底物和待筛选化合物，检测端粒酶活性的变化来筛选抑制剂。这种方法虽然在一定程度上简化了操作流程，但仍然存在一些问题。例如，端粒酶的吸附效率难以保证，不同批次的实验可能存在较大差异，从而影响实验结果的重复性。而且，该方法对实验条件的要求也较为苛刻，如pH值、离子强度等因素都会对端粒酶的吸附和活性产生影响，需要精确控制。

细胞实验则是将待筛选化合物作用于含有端粒酶活性的细胞，通过检测细胞的生长、增殖、凋亡等指标来评估化合物对端粒酶的抑制作用。这种方法能够更直接地反映化合物在细胞水平的作用效果，但也存在明显的局限性。细胞实验需要大量的细胞培养工作，耗费时间和人力成本较高。而且，细胞实验受到细胞种类、培养条件、细胞状态等多种因素的影响，结果的稳定性和可靠性较差。细胞内存在复杂的代谢和信号转导网络，可能会干扰化合物对端粒酶的直接作用，导致结果的解读困难。

这些传统的端粒酶抑制剂筛选方法存在操作复杂、样品消耗量大、结果不稳定、成本高、受干扰因素多等问题，难以满足大规模、高效、准确筛选新型端粒酶抑制剂的需求。因此，开发一种更为高效、灵敏、可靠的筛选方法迫在眉睫。

1.3酵母三杂交系统的优势

近年来，酵母三杂交技术逐渐崭露头角，成为筛选酶抑制剂的新方法。酵母三杂交系统是在酵母双杂交系统的基础上发展而来的，它巧妙地利用了酵母转录因子的特异性相互作用，能够有效地筛选出与目标酶相互作用的抑制剂。

酵母三杂交系统的原理基于酵母细胞的转录调控机制。在该系统中，通常包含三种成分：目标蛋白（与DNA结合域BD融合）、小分子（作为第三方调节因子）以及与转录激活域AD融合的另一个蛋白质。当小分子与目标蛋白结合后，会诱导目标