CEAMAB的制备、纯化及其双抗夹心ELISA检测方法的初步建立.docxVIP

CEAMAB的制备、纯化及其双抗夹心ELISA检测方法的初步建立

一、CEAMAB的制备

（一）免疫原制备

采用重组人癌胚抗原（CEA）作为免疫原，将CEA蛋白与弗氏完全佐剂按1:1比例充分乳化，制备成免疫复合物，用于后续小鼠免疫。

（二）小鼠免疫

选取6-8周龄雌性BALB/c小鼠，通过腹腔注射方式进行免疫。首次免疫剂量为50μg/只，后续每隔2周进行一次加强免疫，加强免疫时将弗氏完全佐剂替换为弗氏不完全佐剂，剂量不变。末次加强免疫后7天，通过尾静脉取血，采用间接ELISA法检测小鼠血清中抗CEA抗体效价，筛选效价≥1:10000的小鼠用于细胞融合。

（三）杂交瘤细胞制备

骨髓瘤细胞准备：复苏SP2/0骨髓瘤细胞，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基在37℃、5%CO?培养箱中培养，确保细胞处于对数生长期，活力≥95%。

细胞融合：取效价合格小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞按5:1-10:1比例混合，在37℃下用50%聚乙二醇（PEG4000）进行融合，融合时间为1-2分钟。融合后加入RPMI-1640培养基终止反应，离心后将细胞沉淀重悬于含HAT筛选培养基的96孔细胞培养板中，置于培养箱中培养。

杂交瘤筛选与克隆化：融合后第7-10天，用HAT培养基进行筛选，去除未融合的脾细胞和骨髓瘤细胞；第14天更换为HT培养基，继续培养。采用间接ELISA法检测孔中细胞上清液，筛选抗CEA阳性孔。对阳性孔进行3次有限稀释法克隆化培养，获得能稳定分泌抗CEA单克隆抗体（CEAMAB）的杂交瘤细胞株。

二、CEAMAB的纯化

（一）腹水制备

将稳定分泌CEAMAB的杂交瘤细胞按1×10?个/只的剂量腹腔注射到预先用液体石蜡处理过的BALB/c小鼠体内，7-10天后收集小鼠腹水。

（二）ProteinA亲和层析纯化

样品预处理：将收集的腹水用0.22μm滤膜过滤，去除杂质；按1:4比例用BindingBuffer（0.02mol/LPBS，pH7.4）稀释，调节pH至7.4。

层析操作：将预处理后的样品上样至ProteinA亲和层析柱，用BindingBuffer洗脱未结合的杂蛋白，直至紫外检测器（280nm）吸光度值降至基线；再用ElutionBuffer（0.1mol/L柠檬酸缓冲液，pH3.0）洗脱结合的CEAMAB，收集洗脱峰。

透析脱盐：将收集的CEAMAB洗脱液转入透析袋，在0.02mol/LPBS（pH7.4）中4℃透析24小时，期间更换透析液3次，去除残留的柠檬酸和盐分。

纯度与浓度检测：采用SDS电泳检测纯化后CEAMAB的纯度，考马斯亮蓝染色后观察，纯度需≥90%；用紫外分光光度计在280nm处测定吸光度值，按公式（浓度=A280×稀释倍数×1.45-0.74×A260）计算CEAMAB浓度。

三、双抗夹心ELISA检测方法的初步建立

（一）试剂准备

包被抗体：选取纯化后的CEAMAB（1号株）作为包被抗体，用0.05mol/L碳酸盐缓冲液（pH9.6）稀释。

酶标抗体：将另一株CEAMAB（2号株）与辣根过氧化物酶（HRP）通过戊二醛法偶联，制备酶标抗体，用含10%胎牛血清的PBS-T缓冲液稀释。

标准品：将重组CEA蛋白用PBS稀释，制备浓度为0、1、5、10、20、50ng/mL的标准品溶液。

底物与终止液：底物为TMB显色液，终止液为2mol/LH?SO?。

（二）检测步骤优化

包被条件优化：将包被抗体按0.5、1、2μg/mL的浓度加入96孔ELISA板，每孔100μL，4℃包被12小时或37℃包被2小时；经PBS-T洗涤3次后，加入5%脱脂奶粉封闭液，每孔200μL，37℃封闭1小时，洗涤后备用。通过比较不同包被浓度下标准品的吸光度值，确定最佳包被浓度为1μg/mL。

酶标抗体浓度优化：将酶标抗体按1:500、1:1000、1:2000的比例稀释，在最佳包被条件下与10ng/mLCEA标准品反应，37℃孵育1小时，洗涤后加入TMB显色液，37℃避光显色15分钟，加终止液后测定450nm处吸光度值。选择吸光度值在1.0-2.0之间的稀释比例，确定最佳酶标抗体稀释度为1:1000。

反应时间优化：固定包被浓度和酶标抗体浓度，分别设置抗原孵育时间（30分钟、1小时、1.5小时）和显色时间（10分钟、15分钟、20分钟），通过检测吸光度值，确定