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生物玻璃浸提液对海马神经元生物相容性的影响及其生物活性的机制研究

一、引言

海马体作为中枢神经系统中参与学习记忆、情绪调节的关键脑区，其神经元的存活与功能稳定对维持大脑正常生理活动至关重要。神经退行性疾病（如阿尔茨海默病）、脑损伤等病理状态下，海马神经元易出现凋亡、突触功能异常，进而导致认知障碍等严重后果。因此，寻找能促进海马神经元存活、改善其功能的生物材料，成为神经再生医学领域的研究热点。

生物玻璃因具有良好的生物相容性、降解性及骨诱导活性，已广泛应用于骨组织工程。近年来研究发现，生物玻璃浸提液中释放的Si、Ca、P等离子可通过调控细胞信号通路，影响神经细胞的增殖与分化，但其对海马神经元的具体作用及机制尚未明确。此外，“睛”作为与视觉神经、中枢神经存在紧密关联的器官，海马神经元功能异常也可能间接影响视觉信号处理，本研究若能明确生物玻璃浸提液对海马神经元的积极作用，或将为“睛”相关神经保护及跨器官神经调控提供新的研究思路，兼具理论价值与潜在应用创意。

本研究旨在通过体外培养海马神经元，分析不同浓度生物玻璃浸提液对神经元存活率、形态发育及功能相关蛋白表达的影响，揭示其生物相容性特征；同时从离子作用、信号通路激活角度，阐明生物玻璃浸提液调控海马神经元活性的分子机制，为生物玻璃在神经修复及“睛-脑”关联领域的应用提供实验依据。

二、材料与方法

（一）实验材料

生物玻璃制备：采用溶胶-凝胶法制备SiO?-CaO-P?O?体系生物玻璃，经高温烧结后粉碎，过200目筛，备用。

浸提液配制：参照ISO10993-5标准，将生物玻璃粉末按0.1g/mL、0.2g/mL、0.5g/mL浓度溶于神经元完全培养基（Neurobasal培养基+2%B27+1%双抗），37℃、5%CO?条件下浸泡72h，0.22μm滤膜过滤除菌，得到低、中、高浓度浸提液，以不含生物玻璃的完全培养基作为对照组。

海马神经元分离与培养：取新生1-2dSD大鼠，无菌条件下分离海马组织，0.25%胰蛋白酶消化15min，终止消化后吹打制成单细胞悬液，调整细胞浓度至5×10?cells/mL，接种于多聚赖氨酸包被的培养板/爬片，置于37℃、5%CO?培养箱培养，每2d换液1次，培养第7d用于后续实验。

（二）实验方法

生物相容性评价

（1）细胞存活率检测：采用CCK-8法，将培养第7d的海马神经元分为对照组、低/中/高浓度浸提液组，每组设5个复孔，加入对应浸提液继续培养24h、48h后，每孔加入10μLCCK-8试剂，孵育2h后测定450nm处吸光度值，计算细胞存活率（实验组吸光度/对照组吸光度×100%）。

（2）形态学观察：采用免疫荧光染色法，培养板中爬片神经元经4%多聚甲醛固定、0.3%TritonX-100透化后，加入神经元特异性标志物β-微管蛋白Ⅲ（β-TubulinⅢ）一抗（1:500）孵育过夜，荧光二抗（1:1000）孵育1h，DAPI染核，激光共聚焦显微镜观察神经元胞体大小、突起长度及分支数量，ImageJ软件定量分析。

生物活性机制探究

（1）浸提液离子浓度检测：采用电感耦合等离子体发射光谱仪（ICP-OES）测定各浓度浸提液中Si??、Ca2?、P??离子浓度。

（2）功能相关蛋白表达检测：采用WesternBlot法，提取各组神经元总蛋白，检测突触相关蛋白（突触素Synaptophysin、突触后致密蛋白95PSD-95）、存活相关蛋白（Bcl-2、Bax）的表达水平，以GAPDH为内参，灰度值分析蛋白相对表达量。

（3）信号通路验证：采用免疫荧光与WesternBlot结合法，检测磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）通路关键蛋白（p-PI3K、p-Akt）的表达，同时设置PI3K抑制剂（LY294002）干预组，观察浸提液对Akt磷酸化及神经元存活率的影响。

（三）统计学分析

所有实验数据采用SPSS26.0软件分析，计量资料以“均数±标准差（x±s）”表示，多组间比较采用单因素方差分析（ANOVA），两两比较采用LSD-t检验，P0.05为差异具有统计学意义。

三、结果

（一）生物玻璃浸提液对海马神经元存活率的影响

CCK-8结果显示（图1）：与对照组相比，低、中浓度浸提液培养24h、48h后，海马神经元存活率无显著差异（P0.05）；高浓度浸提液培养24h时存活率降至（82.3±4.1）%，48h时降至（70.5±3.8）%，差异具有统计学意义（P0.05）。提示低、中浓度生物玻璃浸提液对海马神经元无毒性，具