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柔嫩艾美耳球虫抗药性相关基因M20的克隆与检测体系构建研究

一、引言

1.1研究背景与意义

鸡球虫病是由艾美耳属球虫引起的一种常见且危害严重的寄生性原虫病，主要侵害鸡的肠道上皮细胞。该病在全球范围内广泛分布，尤其对15-50日龄的雏鸡影响巨大，发病率和致死率均较高，成年鸡多为带虫者。鸡感染球虫后，会出现精神萎靡、食欲不振、羽毛松乱、腹泻（粪便带血）、脱水、贫血等症状，严重时甚至死亡。对于产蛋鸡而言，球虫病还会导致产蛋量显著下降。

目前，药物防治是控制鸡球虫病的主要手段。市场上的抗球虫药种类繁多，主要分为化学合成药物和聚醚类离子载体抗生素等。然而，由于长期不规范地使用药物，球虫抗药性问题日益严峻。至今，几乎已从养鸡场中分离出对所有使用过抗球虫药具有抗药性的虫株，且抗药性产生的时间缩短、程度日趋严重，从单一抗性发展为多重、交叉抗性。抗药性的出现使得药物防治效果降低甚至失效，不仅导致鸡只死亡、增重减缓、产蛋减少、饲料利用率降低，还增加了养殖成本，给养鸡业带来了巨大的经济损失，已成为球虫病防治中最棘手的问题。

对控制某一特定药物抗药性基因的检测，对于监测抗药性的蔓延和指导用药策略具有重要意义。通过检测抗药性相关基因，能够及时了解球虫抗药性的发展态势，为合理用药提供科学依据，从而提高药物防治效果，减少药物滥用，降低养殖成本，保障养鸡业的健康发展。本研究聚焦于柔嫩艾美耳球虫抗药性相关基因M20，旨在深入探究其功能和作用机制，并建立快速、准确的检测方法，为鸡球虫病的防治提供新的技术手段和理论支持。

1.2国内外研究现状

国内外学者针对鸡球虫病开展了大量研究工作。在抗药性方面，早期主要集中于抗药性虫株的报道以及现场虫株药物敏感性的调查。例如，Cuckler等早在20世纪50年代就成功诱导出抗药性虫株，但当时未引起足够重视。随着养鸡业的发展和球虫抗药性问题的加剧，研究逐渐转向抗药机理的探讨。

国外在鸡球虫抗药性基因研究领域取得了一定进展。通过分子生物学技术，如cDNA阵列、分子杂交技术和生物信息学分析，对球虫抗性株和敏感株的表达谱差异进行研究，发现一些基因的表达变化与抗药性相关。然而，这些研究多侧重于少数已知基因，对于新的抗药性相关基因的挖掘仍有待加强。

国内对鸡球虫抗药性的研究也在不断深入。孔繁瑶、刘群等对广东、山东、陕西等地鸡球虫抗药性进行了调查研究，证实鸡球虫抗药性现象普遍存在。同时，部分研究尝试利用随机扩增多态性DNA技术（RAPD）等方法分析球虫基因组DNA多态性，寻找与抗药性相关的特异条带，但尚未取得突破性成果。

目前，针对柔嫩艾美耳球虫抗药性相关基因M20的研究较少，对其功能和作用机制的了解几乎空白。深入研究M20基因，有助于进一步揭示球虫抗药性的分子机制，填补该领域的研究空白，为鸡球虫病的防治提供新的靶点和思路。

1.3研究目标与内容

本研究旨在克隆柔嫩艾美耳球虫抗药性相关基因M20，并建立其检测方法，具体研究内容如下：

M20基因的克隆与序列分析：根据前期构建的抑制性消减文库及相关技术获得的M20基因信息，设计引物，通过PCR技术从柔嫩艾美耳球虫基因组中扩增M20基因，对扩增产物进行测序和序列分析，明确其全长序列、开放阅读框及编码的氨基酸序列等。

M20基因的表达分析：采用实时荧光定量PCR技术，检测M20基因在柔嫩艾美耳球虫不同发育阶段（未孢子化卵囊、孢子化卵囊、子孢子和裂殖子）以及抗药株和敏感株中的表达水平，分析其表达差异，初步探讨其与抗药性的关系。

M20基因检测方法的建立：基于M20基因序列，设计特异性引物和探针，建立实时荧光定量PCR检测方法，对该方法的特异性、重复性和灵敏度进行验证，确保其准确性和可靠性。

检测方法的实际应用验证：运用建立的检测方法，对田间采集的柔嫩艾美耳球虫样本进行检测，同时进行鸡体药物敏感试验，将检测结果与鸡体试验结果进行对比分析，验证检测方法在实际应用中的有效性。

1.4研究方法与技术路线

本研究综合运用分子生物学、生物信息学等方法开展研究工作。在分子生物学方面，利用PCR技术进行基因扩增，实时荧光定量PCR技术检测基因表达水平；在生物信息学方面，借助相关软件和数据库对基因序列进行分析。

技术路线如下：首先，从鸡球虫田间株混合种中，采用单卵囊分离技术获得柔嫩艾美耳球虫纯种，并进行鉴定。然后，提取该球虫的基因组DNA，根据设计的引物进行PCR扩增，获取M20基因，对其进行测序和序列分析。接着，提取不同发育阶段以及抗药株和敏感株的RNA，反转录为cDNA后，利用实时荧光定量PCR技术检测M20基因的表达水平。同时，基于M20基因序列设计特异性引物和探针，建立实时荧光定量PC