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基于dsRNA技术解析旋毛虫Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂基因功能

一、引言

1.1研究背景与意义

旋毛虫（Trichinellaspiralis）是一种重要的食源性寄生虫，可引起旋毛虫病。旋毛虫病是一种全球性的人兽共患病，严重威胁着人类健康和畜牧业发展。人类主要通过食用生或不熟的含有旋毛虫幼虫的肉类感染旋毛虫病，其潜伏期一般为2-46天，多数在14天以内。根据幼虫在体内的发育阶段、侵入部位和病变程度的不同，临床表现可分为小肠侵入期、幼虫移行期和包囊形成期。在小肠侵入期，幼虫与成虫钻入肠黏膜，以肠绒毛为食，造成黏膜充血、水肿、出血和浅表溃疡，患者可能会出现恶心、呕吐、腹泻、腹痛、便秘、厌食等症状。进入幼虫移行期，幼虫移行过程中所引起的炎症反应为主要特征，患者可能会出现急性动脉内膜炎、全身性血管炎、水肿、肌痛和发热等症状，肌痛尤为明显，常为全身性，但以腓肠肌为最重。包囊形成期是旋毛虫病的恢复期，随着肌肉中包囊形成，急性炎症消退，全身性症状如发热、水肿和肌痛逐渐减轻，但患者可能会出现显著消瘦、乏力等症状。

丝氨酸蛋白酶抑制剂在旋毛虫的生长、发育、繁殖和致病过程中发挥着重要作用。它能够调节旋毛虫体内的蛋白酶活性，维持虫体的正常生理功能。同时，丝氨酸蛋白酶抑制剂还参与旋毛虫与宿主的相互作用，影响旋毛虫的感染和致病机制。例如，有研究表明旋毛虫成虫丝氨酸蛋白酶抑制剂能够抑制宿主的免疫反应，从而更好地维护寄生虫在宿主体内的生存环境，还能抑制人体的血小板活化，对宿主的血凝能力产生一定的抑制作用，并在一定程度上防止宿主对旋毛虫成虫产生的过度免疫反应，保护了寄生虫在宿主体内的细胞环境。此外，该抑制剂还具有抗炎、抗肿瘤和抗病毒等生物活性。因此，深入研究旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制剂基因的功能，对于揭示旋毛虫的致病机制、开发新的诊断方法和治疗药物具有重要意义。

1.2国内外研究现状

在旋毛虫基因功能研究方面，国内外学者已经取得了一定的进展。通过对旋毛虫基因组的测序和分析，发现了一些与旋毛虫生长、发育、繁殖和致病相关的基因。例如，利用高通量测序技术对旋毛虫基因组进行测序，揭示了其复杂的基因组成和功能模块，为深入理解旋毛虫的遗传机制提供了基础。同时，通过基因编辑技术，如CRISPR-Cas系统，对旋毛虫的关键基因进行敲除或替换，研究其对旋毛虫生存、繁殖和致病能力的影响。

在dsRNA技术应用于寄生虫研究方面，也取得了不少成果。dsRNA可以触发RNA干扰（RNAi）机制，使靶基因的表达受到抑制，从而实现对基因功能的研究。在旋毛虫研究中，通过浸泡法或电转法将dsRNA导入旋毛虫肌幼虫或成虫体内，能够有效抑制靶基因的转录和表达。例如，有研究通过浸泡法将Tspst特异性的dsRNA导入旋毛虫肌幼虫体内，应用Real-timePCR和Westernblot检测发现，经dsRNA-Tspst浸泡处理后幼虫Tspst基因的转录和表达分别下降71.87%和61.9%。

对于Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂，目前的研究主要集中在其结构特征、功能和作用机制方面。Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂具有独特的结构特征，含有多个Kazal结构域，这些结构域对于其发挥抑制蛋白酶活性的功能至关重要。在功能上，它能够抑制多种丝氨酸蛋白酶的活性，参与细胞的生长、分化、凋亡等过程。然而，关于旋毛虫Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂基因的功能研究还相对较少，尤其是利用dsRNA技术对其进行功能验证的研究还存在空白。

1.3研究目标与内容

本研究旨在利用dsRNA技术对旋毛虫Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂基因功能进行初步研究，具体研究内容包括：

克隆旋毛虫Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂基因（TsKaSPI），并对其进行生物信息学分析，了解其基因结构、氨基酸序列特征以及与其他物种Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂的同源性。

合成TsKaSPI基因的dsRNA，优化dsRNA的合成条件和质量，确保其能够有效地介导RNA干扰。

通过浸泡法和电转法将dsRNA导入旋毛虫肌幼虫和成虫体内，优化转染浓度和时间，确定最佳的转染条件，以实现对TsKaSPI基因的高效沉默。

检测dsRNA对TsKaSPI基因转录水平和蛋白表达水平的影响，采用Real-timePCR和Westernblot等技术，分析基因沉默效果。

研究TsKaSPI基因沉默对旋毛虫幼虫体外存活及侵入肠上皮细胞能力的影响，通过体外培养实验，观察幼虫的存活情况和侵入肠上皮细胞的效率。

探讨TsKaSPI基因沉默对旋毛虫体内发育及雌虫生殖力的影响，将dsRNA处理后的幼虫感染小鼠，观察旋毛虫