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一概念
拉下实验是一种在体外研究两种或多种蛋白质之间物理性相互作用的方法
二拉下实验的目的
作为验已知蛋白作用关系的一种手段
作为发现未知蛋白作用关系的一种手段
三实验原理
该实验本质是一种亲和纯化法
在一个下拉实验中，标记的钓饵蛋白可被固定在特异化的亲和配体上
形成能够纯化与钓饵蛋白相作用的其他蛋白质的二级亲和基质
再将钓饵蛋白的二级亲和基质与一系列猎物蛋白一起温浴
然后采用适当的洗脱方法洗脱目标蛋白
四实验步骤
1将裂解物中带有融合标签的诱饵蛋白固定
2洗脱未结合的蛋白质（离心旋转）
3猎物蛋白与固定的钓饵蛋白相结合
4洗脱未结合的蛋白质
5洗脱相互作用的蛋白质复合物
6SDS——PAGE胶上分析相互作用的蛋白质
五钓饵蛋白的来源
1传统纯化法纯化所得的蛋白质连接上一个亲和标记
2表达重组的融合蛋白
六稳定作用关系与瞬时作用关系
蛋白质之间的作用可能是稳定的也可能是瞬时的
瞬时作用通常与转运或酶催化有关
稳定作用
稳定的蛋白质的相互作用关系最容易用拉下实验分离
这种蛋白质的相互作用构成了细胞结构，蛋白质之间的解离常数低，蛋白质之间作用强。
可用大量的高离子缓冲液洗涤
相反如果解离常数高，则通过PH、盐类型、浓度条件的优化来提高蛋白质复合物的回收效果
瞬时作用
瞬时作用关系是由蛋白质瞬时作用引起的
瞬时作用主要发生在转运和酶反应过程中
通常需要加入辅因子+未水解的NTP类似物来捕获依赖辅因子和NTP的猎物蛋白
七洗脱
洗脱复合物
1SDS——PAGE加样缓冲液（变性蛋白质）
2钓饵蛋白标记物的特异竞争性分析物（非变性蛋白质）
3盐浓度梯度上升、PH梯度下降
八钓饵-猎物蛋白复合物的凝胶电泳检测
洗脱下来的蛋白质复合物可经SDS显示出来（及凝胶染色、Western杂交、S35放射性同位素等方法）
聚丙烯胺凝胶中蛋白质带的回收
胰蛋白酶消化
消化片段的质谱分析
鉴定
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