核酸的紫外吸收及含量测定张昱86课件讲解.pptxVIP

核酸的紫外吸收及含量测定主讲人：张昱TheSecondaryStructureofRNAandRibozymes

信噪比知识迁移02我们在分析化学中接触过信噪比的概念；在进行基因测序或其他一些相关实验前，都要求提供的核酸样品达到一定的浓度，才可以被检测出来，因此需要对核酸进行定量测定。信号-仪器噪音示意图

目录CONTENTS一、核酸的紫外吸收二、核酸的含量测定

教学目标06知识目标素质目标能力目标了解影响核酸紫外测定的因素；熟悉核酸含量测定的各种方法；掌握核酸紫外测定的方法。能理解开展核酸紫外测定工作的意义；能指出各类核酸含量测定方法的优劣和应用场合。培养对比-分析解决问题的能力；建立流程化的思维能力。04

一、核酸的紫外吸收

1.核酸的紫外吸收06碱基具有共轭双键，使碱基、核苷、核苷酸和核酸在240~290nm的紫外波段有强烈的光吸收，最大吸收波长（λmax）为260nm；紫外吸收性质可用于核酸的纯度鉴定、含量计算、变性和复性的程度判断。

1.核酸的紫外吸收07核酸的紫外吸收可用于纯度判定：纯DNA在260nm和280nm下的吸光度比值（A260nm/A280nm）应为1.8（1.65~1.85）；若大于1.8，表明被RNA污染。纯RNA的A260nm/A280nm应为2.0。若溶液中含有杂蛋白或苯酚，则A260nm/A280nm比值会显著下降。

1.核酸的紫外吸收08紫外线会造成DNA损伤，诱发突变和细胞死亡。紫外辐射使一条DNA链上相邻的嘧啶基共价结合形成环丁烷嘧啶二聚体

二、核酸的含量测定

102.核酸的含量测定紫外分光光度法在一定的pH条件下，测定样品在260nm下的紫外吸光率，可以计算样品中核酸的含量。纯的核酸样品，1μg/mLDNA溶液的A260nm=0.020；1μg/mLRNA溶液的A260nm=0.022~0.024。但在实际测定中存在以下问题：①无法判别DNA是否降解，易受降解核酸、游离核苷酸及其他杂质的干扰；②无法区分DNA和RNA；③样本中DNA浓度0.25ng/μL时无法获取准确含量结果。

112.核酸的含量测定定磷法利用核酸分子中磷元素含量相对稳定的特性，在酸性环境中，核酸中的磷与定磷试剂（如钼酸铵）反应生成磷钼酸，进一步在还原剂作用下转化为蓝色的木兰化合物，测定其在650~660nm下的最大吸收峰，其吸光度与核酸中的磷含量成正比，间接反映核酸浓度。适用于粗略估计的场合，测定范围在1-10μg。

122.核酸的含量测定定糖法核酸中的核糖或脱氧核糖在酸性条件下脱水生成醛类化合物，可与特定成色剂（如间苯二酚）反应，生成有色化合物，其颜色深浅与戊糖含量成正比，间接反映核酸浓度。核糖生成的绿色化合物在670nm处有最大吸收；脱氧核糖生成的蓝色化合物在595nm处有最大吸收。该方法适用于初步估计的场合，测定范围在20~250μg，准确定低于紫外吸收法和定磷法。

132.核酸的含量测定荧光光度法基于荧光染料与核酸结合后产生荧光信号进行测定。该方法可以区分DNA和RNA，不易受杂质的干扰；能检测极低浓度的核酸，广泛用于微量核酸的定量检测，如基因表达分析、病毒载量检测、基因组学研究等领域。

142.核酸的含量测定qPCR法在PCR反应体系中加入荧光染料或荧光探针，实时监测荧光信号。该方法特异性强，灵敏度高，可定量范围广，能实现自动化操作和高通量检测，广泛应用于基因表达定量分析、病原体检测与鉴定、遗传病诊断、药物研发等领域。注：PCR是一种在体外快速、大量复制特定DNA片段的技术。常用于在获取了微量DNA之后扩增其数量以达到检测限/定量限的场合。

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