第二章-蛋白质分离纯化技术.pptVIP

第二章蛋白质的分离与纯化（三）;;色谱技术（chromatography）;色谱技术的原理;色谱法分类;;;根据物料中各组分对固定相(吸附剂)的吸附程度不同，以及其在相应的流动相(溶剂)中溶解度的差异来实现。经反复的吸附—解吸—再吸附—再解吸的过程，达到分离目的。

无化学键引入，只存在相对较弱的氢键力、范德华力和偶极力相互作用。;分配系数(a)

指在一定温度和压力条件下物质在固定相和流动相两部分浓度达到平衡时的浓度比值。;2、应用实例

——双向纸色谱法;迁移率（Rf）

各组分在滤纸上的移动速度

Rf值的大小

取决于该组分的分配系数。分配系数大者移动速度慢，其Rf值也小；反之分配系数小者，移动速度快，Rf值也大。;氨基酸双向纸色谱图谱;三、离子交换色谱（ion-changechromatography）;;;基本操作;离子交换剂的选择;基质的选择;;应用实例;;;凝胶色谱是按照蛋白质分子量大小进行分离的技术，又称之凝胶过滤、分子筛色谱或排阻色谱。;优点：凝胶属于惰性载体，不带电荷，吸附力弱，操作条件比较温和，不改变样品生物学活性，温度范围广，不需要有机溶剂，分离效果好。广泛应用于蛋白质、核酸等的分离纯化。

缺点：样品被不断稀释，上样量不能太大，否则分辨率变差。

;1、原理;大分子物质沿凝胶颗粒间隙随洗脱液移动，流程短，移动速率快，先被洗出色谱柱。

小分子物质可通过凝胶网孔进入颗粒内部，然后再扩散出来，故流程长，移动速度慢，最后被洗出色谱柱。;2、凝胶过滤色谱的基质;带网孔的葡聚糖珠;小分子;天花粉毒蛋白的凝胶过滤分离;;五、亲和色谱（affinitychromatography）;疏水色谱（HC）是根据分子表面疏水性差别来分离蛋白质和多肽等生物大分子的一种较为常用的方法。

疏水性弱的物质，在较高离子强度的溶液时被洗脱下来，当离子强度降低时，疏水性强的物质才随后被洗脱下来。;;疏水配基;疏水基质;;应用实例;2、钙依赖的疏水色谱;从玉米胚芽鞘中分离

钙调蛋白和钙激活的蛋白激酶;3、用作“去垢剂交换色谱”;聚焦色谱（Chromatofocusing）;几种主要色谱方法比较;电泳技术（electrophoresis）;电泳的一般原理

;电泳技术分类（按实验装置分类）

;常用电泳技术;;聚丙烯酰胺凝胶电泳优点

化学性能稳定，对pH和温度变化不敏感；

重复性好；

灵敏度高，可达10-6g；

分辨率高（样品浓缩效应，分子筛效应，电荷效应）。;毛细管电泳技术简介;毛细管电泳仪的基本组成;毛细管电泳的特点;毛细管电泳的特点;毛细管电泳分离模式;分离对象与模式的选择;不同分子量蛋白的分离;*;4种碱性蛋白的分离;毛细管等点

聚焦电泳