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聚丙烯酰胺凝胶电泳实验流程详解

聚丙烯酰胺凝胶电泳（PolyacrylamideGelElectrophoresis,PAGE）是生物化学与分子生物学研究中分离、分析蛋白质和核酸的核心技术之一。其凭借凝胶孔径的可控性、高分辨率及良好的重复性，在蛋白质分子量测定、纯度分析、样品制备等方面发挥着不可替代的作用。本文将从实验原理、试剂准备、操作流程到注意事项进行系统性阐述，旨在为科研工作者提供一份实用且严谨的实验指南。

一、实验原理简述

PAGE的分离基础主要基于样品中各组分的分子量大小、电荷性质及其与凝胶介质的相互作用。聚丙烯酰胺凝胶由丙烯酰胺单体（Acr）和少量交联剂N,N-亚甲基双丙烯酰胺（Bis）在引发剂（如过硫酸铵，APS）和加速剂（如四甲基乙二胺，TEMED）的作用下聚合交联而成三维网状结构。

在电泳过程中，蛋白质样品在电场作用下向与其所带电荷相反的电极移动。凝胶的分子筛效应使得较小分子更容易穿过凝胶孔隙，迁移速度更快；而较大分子则受到更大阻力，迁移较慢。此外，样品在浓缩胶中还会经历浓缩效应，使样品在进入分离胶前被高度浓缩成一窄带，进一步提高分离效果。通过调节丙烯酰胺和双丙烯酰胺的浓度比例，可以制备不同孔径的凝胶，以适应不同分子量范围样品的分离需求。

二、实验材料与试剂准备

（一）主要仪器设备

垂直板电泳槽及配套电源、制胶模具（玻璃板、间隔条、梳子）、移液器及配套吸头、涡旋混匀器、恒温水浴锅、天平、pH计、磁力搅拌器、凝胶成像系统（后续检测用）。

（二）主要试剂

1.丙烯酰胺（Acr）与N,N-亚甲基双丙烯酰胺（Bis）储存液：通常配制为一定比例的混合液（如30%Acr-Bis，其中Bis占2.6%或1.3%，根据所需凝胶交联度选择），避光4℃保存。丙烯酰胺具有神经毒性，操作时需佩戴手套和口罩，避免吸入。

2.分离胶缓冲液：如Tris-HCl(pH8.8)，用于配制分离胶。

3.浓缩胶缓冲液：如Tris-HCl(pH6.8)，用于配制浓缩胶。

4.10%十二烷基硫酸钠（SDS）溶液：室温保存，低温易析出，温浴溶解即可。

5.10%过硫酸铵（APS）溶液：临用前新鲜配制，4℃短暂保存。

6.四甲基乙二胺（TEMED）：加速凝胶聚合，避光保存。

7.电泳缓冲液：常用Tris-甘氨酸-SDS缓冲液(pH8.3)，可配制成浓缩液，使用时稀释。

8.样品上样缓冲液（2×或5×）：含SDS、β-巯基乙醇（或DTT）、溴酚蓝（指示剂）、甘油（增加密度），用于样品变性、显色和沉降。

9.蛋白质分子量标准（Marker）：根据目标蛋白分子量范围选择合适的Marker。

10.染色液：如考马斯亮蓝R-250染色液。

11.脱色液：通常为水、甲醇（或乙醇）和冰乙酸的混合液。

三、详细实验流程

（一）实验前准备与安全须知

实验开始前，需仔细检查所有试剂是否在有效期内，溶液是否有沉淀、变色等异常。丙烯酰胺单体具有神经毒性，务必在通风橱内操作，佩戴一次性手套、口罩和护目镜。实验台面应保持整洁，移液器、吸头等耗材需洁净。

（二）凝胶的配制与灌制

1.玻璃板的清洗与组装：

用洗涤剂清洗玻璃板，再用自来水冲洗干净，最后用去离子水润洗2-3次，晾干或用无水乙醇擦拭后吹干。将洗净的玻璃板与间隔条按电泳槽说明书要求组装好，确保底部及两侧无渗漏。将组装好的玻璃板模具垂直固定在制胶架上。

2.分离胶的配制与灌制：

根据所需分离胶浓度（如10%、12%），按比例依次在洁净离心管中加入去离子水、30%Acr-Bis储存液、分离胶缓冲液、10%SDS溶液。轻轻混匀后，加入10%APS溶液（用量通常为凝胶总体积的1%左右）和TEMED（用量通常为凝胶总体积的0.1%左右）。TEMED加入后应立即轻轻颠倒混匀（避免剧烈搅拌产生气泡）。

迅速将配制好的分离胶溶液沿玻璃板内壁缓慢注入模具中，直至液面达到距梳齿下方约1.5-2cm处。小心在胶面上覆盖一薄层去离子水或异丙醇（用于隔绝空气，促进凝胶聚合，并使胶面平整）。室温静置待其聚合（通常需30-60分钟）。聚合完成后，可见明显的界面，倾去上层覆盖液，用去离子水洗涤胶面2-3次，用吸水纸吸干残留水分。

3.浓缩胶的配制与灌制：

按比例依次加入去离子水、30%Acr-Bis储存液、浓缩胶缓冲液、10%SDS溶液。轻轻混匀后，加入10%APS溶液和TEMED，混匀方法同分离胶。

将配制好的浓缩胶溶液注入已聚合的分离胶上方，直至液面接近玻璃板顶端。小心插入干净的梳子，避免产生气泡。若有气泡，可轻轻拔出梳子，让少量浓缩胶溶液流出以排除气泡，再重新插入梳子。室温静置待浓缩胶聚合（通常需20-40分钟）。

（三）样品制备与上样

1.样品处理：

将蛋白质样