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攻克EV71病毒防线：人源化特异性单克隆抗体分泌细胞筛选方法的构建与革新

一、引言

1.1研究背景

肠道病毒71型（Enterovirus71，EV71）是一种单股正链RNA病毒，隶属于小RNA病毒科肠道病毒属。自1969年首次从加利福尼亚一名患有中枢神经系统疾病的婴儿粪便标本中分离出EV71以来，它逐渐成为全球公共卫生领域的重点关注对象，尤其是在亚洲地区。EV71主要通过粪-口途径、呼吸道飞沫以及密切接触传播，具有较强的传染性。

EV71感染引发的疾病谱较为广泛，最常见的是手足口病（Hand,FootandMouthDisease，HFMD）。手足口病多发生于5岁以下儿童，表现为口痛、厌食、低热，手、足、口腔等部位出现小疱疹或小溃疡。虽然多数手足口病患者症状较轻，可在1周内自愈，但部分由EV71感染导致的病例会发展为重症，引发无菌性脑膜炎、脑干脑炎、神经源性肺水肿和心肌炎等严重并发症，甚至导致死亡。早期EV71感染导致的疾病最高致死率达10%-15%，尽管随着医疗水平的提升，致死率有所下降，但在全球范围内，尤其是发展中国家，依然存在着较大的流行风险，严重威胁着儿童的健康和生命安全。例如，在2019年，中国共报告手足口病病例数达120万例，其中由EV71感染导致的重症和死亡病例占据一定比例，给家庭和社会带来了沉重的负担。

在疾病防控方面，目前针对EV71感染尚无特效的治疗药物，主要以对症治疗为主。虽然已经有EV71灭活疫苗上市，但疫苗的应用存在一定局限性，如仅能针对EV71型病毒，无法预防其他肠道病毒引起的手足口病；疫苗的接种覆盖率在不同地区存在差异，部分地区尤其是卫生资源相对匮乏的地区，疫苗接种率较低；此外，疫苗对不同基因型的EV71病毒的保护效果也有待进一步评估。因此，开发特异性、高效的EV71抗体对于疫情的应对和预防具有重要的现实意义。

单克隆抗体（MonoclonalAntibody，mAb）作为一种广泛应用于生物医学领域的分子工具，具有高特异性、高亲和力和高稳定性等优点。在免疫治疗方面，单克隆抗体能够特异性地识别并结合病毒抗原，阻断病毒的感染途径，发挥中和病毒的作用，为病毒感染性疾病的治疗提供了新的策略。在诊断领域，单克隆抗体可用于开发高灵敏度和特异性的诊断试剂，实现对病毒感染的早期准确诊断，有助于疫情的监测和防控。在药物研发中，单克隆抗体也常常作为先导分子，为新型抗病毒药物的开发提供基础。目前，通过抗原免疫小鼠或兔子，然后通过细胞融合技术筛选出具有特异性的单克隆抗体是一种主要的制备方法。然而，由于小鼠抗体在人体中会产生免疫原性反应，可能引发过敏等不良反应，限制了其在临床治疗中的应用。相对较为安全和经济的制备途径是通过人源化技术制备出特异性的单克隆抗体，这种制备方法成为了当前的研究重点。因此，建立和优化EV71人源化特异性单克隆抗体分泌细胞筛选方法，对于获得高效、安全的EV71单克隆抗体至关重要，具有重要的研究价值和临床应用前景。

1.2研究目的与意义

本研究旨在建立并优化EV71人源化特异性单克隆抗体分泌细胞筛选方法，具体目标如下：首先，利用单克隆细胞技术，从多种细胞系中筛选、鉴定并优化出适合生产特异性EV71单克隆抗体的细胞系，该细胞系应具备良好的分泌效率和稳定性，能够持续、高效地分泌高质量的单克隆抗体。其次，通过对细胞培养基的配方、温度、CO?浓度、培养周期、通气等培养条件进行系统优化，调节细胞生长和抗体产量，提高细胞生长速度和细胞分泌抗体的产量，以满足大规模生产的需求。最后，采用ELISA、Westernblot和流式细胞术等方法，建立快速、可靠的EV71特异性单克隆抗体筛选方法，并优化其抗体纯度和稳定性，确保筛选出的单克隆抗体具有高特异性、高亲和力和高稳定性。

本研究的意义主要体现在以下几个方面：在EV71感染治疗和预防方面，通过本研究建立的筛选方法制备出的具有优异特异性和活性的单克隆抗体，有望成为治疗EV71感染的新型药物，为临床治疗提供新的手段。单克隆抗体可用于开发高效的诊断试剂，实现对EV71感染的早期诊断和疫情监测，有助于及时采取防控措施，降低疾病的传播风险。该研究对于开发和优化其他疾病相关单克隆抗体的制备方法也具有重要的参考意义。从技术层面来看，本研究中涉及的细胞系筛选、培养条件优化以及抗体筛选方法的建立与优化等技术，可为其他病毒单克隆抗体制备提供技术借鉴和经验参考，推动单克隆抗体技术在生物医学领域的广泛应用和发展，为攻克更多病毒感染性疾病提供技术支持。

1.3国内外研究现状

在国外，对EV71单克隆抗体制备及筛选方法的研究开展较早。一些研究团队利用传统的