无标记基因技术赋能番茄品质革新：异黄酮合成酶基因转化的探索与实践.docxVIP

无标记基因技术赋能番茄品质革新：异黄酮合成酶基因转化的探索与实践

一、引言

1.1研究背景与意义

异黄酮是一类在植物中广泛存在的次生代谢产物，尤其是在豆科植物中含量较为丰富。它具有多种对人体健康有益的作用，在医学和保健领域展现出巨大的应用潜力。从预防疾病的角度来看，异黄酮具有防癌抗癌的功效。相关研究表明，异黄酮能够阻碍癌细胞的扩散和生长，在消除癌症的同时，还不会影响正常的细胞。例如，它对乳腺癌、白血病、卵巢癌等多种癌症都具有一定的预防作用。在心血管健康方面，异黄酮可以扩张血管，调节血脂，进而预防心脑血管疾病，如冠心病、心绞痛、心肌缺血、冠状动脉硬化、脑血栓等。对于女性群体，异黄酮的作用更为显著。女性30岁以后，体内雌激素会逐渐分泌不足，从而开始衰老，而异黄酮能够补充雌激素，具有抗氧化效果，可以使人延缓衰老，让女性皮肤更加光滑有弹性，达到美容养颜的目的，还可以使乳房二次发育，保护乳房健康以及起到丰胸的作用，同时能够延缓女性更年期，改善女性更年期的症状，增加女性阴道上皮细胞的成熟度，增强阴道肌肉弹性，提高性生活质量。

在转基因植物领域，无标记转化技术逐渐成为研究热点。传统的转基因技术在植物转化过程中会引入选择标记基因，如抗生素抗性基因或抗除草剂基因。这些标记基因在筛选转化细胞或组织时发挥了重要作用，但在获得转基因植物之后，其继续表达的产物可能会对环境及植物体的生长发育产生不良影响。例如，抗生素抗性基因有可能被转移到微生物中，增加这些微生物在人或动物消化道内的数量，从而危及抗生素在临床及兽医上的应用；抗除草剂基因如果流动到杂草中，会使其获得抗除草剂性能，进而成为现有除草剂无法杀死的“超级杂草”。此外，可用于植物转基因筛选的标记基因非常有限，难以满足对转基因植物进行二次或多次转化时对多个标记基因的要求。因此，无标记转化技术能够有效解决这些问题，使转基因植物释放后不带选择标记基因，对于从事转基因研究的工作人员以及消费者来说都极为重要，具有广阔的应用前景。

番茄（Solanumlycopersicum）作为一种重要的蔬菜作物，不仅是蔬菜基因工程研究和果实成熟机理研究的模式植物，而且在全球范围内广泛种植，具有很高的经济价值。目前，已经通过基因转化方法获得了延迟成熟、抗病毒、抗病虫害、抗除草剂、抗逆和高品质的优良番茄品种，番茄还被用于药用蛋白生产，作为生物反应器受到广泛关注。然而，在番茄的转基因研究中，标记基因的安全性问题同样限制了其进一步的应用和发展。开展异黄酮合成酶基因无标记转化番茄的研究，一方面可以赋予番茄合成异黄酮的能力，增加番茄的营养保健功效，满足人们对功能性食品的需求；另一方面，利用无标记转化技术可以解决标记基因带来的安全性隐患，为转基因番茄的商业化应用提供技术支持，对于推动番茄产业的发展具有重要的现实意义。

1.2研究目的

本研究旨在建立高效的番茄无标记转化体系，通过优化转化条件和筛选方法，提高转化效率，降低假阳性率。具体而言，将异黄酮合成酶基因导入番茄基因组中，利用无标记转化技术避免选择标记基因的引入，确保转基因番茄的安全性。对导入异黄酮合成酶基因的转基因番茄进行全面分析，包括基因表达水平的检测、异黄酮含量的测定等，以评估异黄酮合成酶基因在番茄中的表达效果和异黄酮的合成能力。通过一系列实验，如田间试验、毒理学试验等，评估转基因番茄的安全性，包括对环境的影响、对非靶标生物的影响以及食用安全性等方面，为转基因番茄的应用潜力提供科学依据，为其商业化推广奠定基础。

1.3国内外研究现状

在异黄酮合成酶基因克隆方面，国内外学者已经取得了一定的进展。研究人员从多种豆科植物中成功克隆出异黄酮合成酶基因，例如从野葛中克隆出野葛异黄酮合成酶（PTS）基因，并对其结构和功能进行了深入研究。通过比对分析发现，PTS基因在不同物种中的序列相似度较高，利用这一特点设计引物，通过PCR扩增等技术获得了PTS基因的完整序列。在功能验证方面，采用过量表达和基因敲除等技术手段，明确了异黄酮合成酶基因在异黄酮生物合成途径中的关键作用。如将PTS基因克隆到表达载体中，通过农杆菌介导法导入野葛组织中，发现过表达PTS基因的野葛组织中野葛异黄酮含量明显增加；采用CRISPR-cas9技术敲除PTS基因后，野葛异黄酮的产量大幅度下降，充分证明了该基因在异黄酮合成中的重要性。

在无标记转化技术方面，国内外也开展了大量的研究。共转化法是较早被研究和应用的方法之一，它将标记基因和关注基因分别构建在不同载体或同一载体的不同T-DNA区域，共转化受体细胞时，可获得共整合有关注基因和选择标记基因的植株，再经过减数分裂实现标记基因与关注基因的分离，从而达到标记基因剔除的目的。位点特异性重组系统法，如Cre/loxP、FLP