大肠杆菌感受态细胞的制备和转化.pptVIP

实验九，十

大肠杆菌感受态细胞的制备和转化;在自然条件下,很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内,但在人工构建的质粒载体中,一般缺乏此种转移所必需的mob基因,因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。如需将质粒载体转移进受体细菌，需将对数生长期的细菌（受体细胞）经理化方法处理后，细胞膜的通透性发生暂时性改变，成为能允许外源DNA分子进入的细胞，称感受态细胞。;转化(Transformation)是将外源DNA分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。;;CaCl2法是以Mendel和Higa（1970）的发现，其基本原理是：细胞处于0～4℃，CaCl2低渗溶液中，大肠杆菌细胞膨胀成球状。转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃90秒热激处理，促进细胞吸收DNA混合物。将细菌放置在非选择性培养基中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型，如卡那霉素耐药基因得到表达，然后将此细菌培养物涂在含卡那霉素的选择性培养基上，倒置培养过夜，即可获得细菌菌落。;;细胞生长状态和密度:

不要用经过多次转接或储于４℃的培养菌，最好从－70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD600来控制。DH5α菌株的OD600为0.5时,细胞密度在5×107个/ml左右(不同的菌株情况有所不同),这时比较合适。密度过高或不足均会影响转化效率。;;1）材料

E.coliDH5α菌株；质粒、

1.5ml离心管（又称eppendorf管）

卡那霉素；

;三.操作步骤;5)4℃,8000rpm离心4min，弃上清液;

6)用100μl预冷的无菌CaC12(0.lmol/L)重新悬浮细胞，冰上备用；;2.转化;注意：

1、含卡那霉素的LB固体培养基的配制:将灭菌的LB固体培养基水浴溶解后冷却至60℃左右,加入Kana储存液,使终浓度为100ug/ml,摇匀后到平板；

2、1小时空间：转化后温浴45min左右，让抗性基因得以表达，再涂抗性平板

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;1.感受态细胞有何特点？如何保证它的质量？

2.如阴性对照中长出菌，原因？

3.还有哪些方法可以将外源基因导入受体细胞？各有什么优缺点？