高效液相色谱法培训.pptVIP

高效液相色谱法;高效液相色谱法（HPLC）是60年代末以经典液相色谱法为基础，引入了气相色谱的理论与实验方法，流动相用高压泵输送，采用高效固定相和在线检测等手段发展而成的分离分析方法。

与气相色谱法相比具有：适用范围广，样品预处理简单，分离效率高，流动相选择范围广，检测方法多为非破坏性的，流出组分可回收等优点。;HPLC;离子抑制色谱（ionsuppressionchromatography）——调节流动相的pH值，抑制组分的解离，增加组分在固定相中的溶解度，改善峰形，以达到分离有机弱酸和弱碱的目的。

离子对色谱（ionpairchromatography）——将反离子加入流动相中，与呈解离状态的被测物作用，生成脂溶性的中性离子对络合物，从而增加了被测物在非极性固定相中的溶解度，改善分离效果，达到分离目的。

常用反离子有：季铵盐——用于酸类

烷基磺酸盐——用于碱类;离子色谱法（ionchromatography）

离子色谱是由经典的离子交换色谱发展起来的一种液相色谱技术，利用物质在离子交换柱上迁移的差异而达到分离，用于亲水性阴阳离子的测定。根据是否采用抑制柱，可分为抑制型离子色谱和非抑制型离子色谱。;空间排斥色谱（stericexclusion?）

也称凝胶色谱，依据被分离组分分子尺寸与凝胶空径大小之间的相对关系而分离，类似于分子筛作用。在一定分子线团尺寸内，分子越大，保留时间越短。

凝胶渗透——以有机溶剂为流动相

凝胶过滤——以水溶液为流动相

对于相同化学组成的高分子化合物，其分子尺寸大小与分子量成正比，因此凝胶色谱可以研究高分子化合物的分子量分布。;胶束色谱(micellarchromatography)

表面活性剂在水中超过某一浓度（临界浓度）时，多余的表面活性剂不再溶解，聚集而成胶束（胶粒）。

以胶束分散体系为流动相的色谱法称为胶束色谱法。它的流动相为胶束多相分散体系，不是真溶液；流动相中不含有机溶剂。

因胶束色谱法的流动相是多相分散体系，在整个色谱体系中又增加了一相，故也被称为假相色谱（pseudophasechromatography）。;;12;14;15;16;进样阀;1;进样注意点

进样阀的废液出口端高度必须与进样针在同一???平位置，以免虹吸作用，使样品向针筒方向回流，或从废液口流出。

使用前后，要用流动相（不含酸碱等缓冲液）或甲醇或水冲洗针孔，用针孔清洗器）。;进样方法

整个定量圈体积进样——为获得好的精密度，进样量应大于定量圈量的2-5倍以上。由于层流影响，需要有过量的样品液来取代管壁上的流动相（见下图）。;检测器

紫外检测器

可变波长检测器

光电二极管阵列检测器

荧光检测器

电化学检测器

蒸发光散射

示差检测器

质谱;色谱图;组分的气溶胶;质谱检测器;UV-VIS;非极性键合相

表面基团为非极性烃基，如C18、C8等，主要用于RP色谱。C18是最常用的非极性键合相，将十八烷基氯硅烷与硅胶表面的硅醇基经多步反应而成。;根据R1、R2基团，含碳量可分为高碳、中碳、低碳型键合相：

高碳R1=R2=CH3载样量大，吸附性能大；

中碳R1=H,≡Si－O－Si(H)－C18H37

R2=Cl≡Si－O

低碳R1=R2=Cl;中等极性键合相——常见的有醚基键合相，这类键合相根据流动相的极性，可作为正相或反相色谱的固定相，应用较少。

极性键合相——可作正相或反相色谱使用

氨基键合相：

硅胶-氨丙硅烷基[－Si－(CH2)3NH2]

氰基键合相：

硅胶-氰乙硅烷基[－Si－(CH2)2CN]

;ZORBAXSB-C18键合相

使用独特的键合方式，用特殊的二异丁基硅烷对硅氧烷键进行保护，防止了极端pH和高温条件下键合相的水解，这些大侧链阻止了键合相的流失，提高了重现性，延长了柱寿命。;ZORBAXExtend-C18色谱柱——采用C-18二齿结构并用特有的步骤进行双基封端。

在pH高达11.5的条件下，用于分离碱性、酸性、中性化合物，峰形优良，柱寿命长。;色谱柱使用注意点：

pH范围2-11.5。使用有机缓冲液，浓度以10-50mM为好。在中高pH下避免使用磷酸盐，碳酸盐缓冲液，

最高操作温度60℃，最佳温度﹤40℃。

分离碱性物质，所用流动相pH值应高于被测物pKa一个单位。;柱pH范围最高温度;色谱柱使用与保存

所有色谱柱使用缓冲液后必须用柱体积20-30倍的水冲洗色谱柱

色谱柱