CN109856394B 一种基于细胞多巴胺释放效应的大麻素类活性物质的检测方法及其检测试剂盒 （浙江诺迦生物科技有限公司）.docxVIP

(19)中华人民共和国国家知识产权局

(12)发明专利

(45)授权

(10)授权公告号CN109856394B公告日2022.04.19

(21)申请号201910306029.5

(22)申请日2019.04.16

(65)同一申请的已公布的文献号申请公布号CN109856394A

(43)申请公布日2019.06.07

审查员黄晓丽

(73)专利权人浙江诺迦生物科技有限公司

地址311200浙江省杭州市萧山区萧山经

济技术开发区启迪路198号杭州湾信

息港E座16楼

(72)发明人范春雷程向荣

(74)专利代理机构杭州浙科专利事务所(普通合伙)33213

代理人周红芳

(51)Int.CI.

C12N15/867(2006.01)权利要求书2页说明书6页附图3页

(54)发明名称

一种基于细胞多巴胺释放效应的大麻素类活性物质的检测方法及其检测试剂盒

(57)摘要

CN109856394B本发明公开了一种基于细胞多巴胺释放效应的大麻素类活性物质的检测方法及其检测试剂盒，所述检测试剂盒包括检测组试剂盒和对照组试剂盒两种成分，所述检测组试剂盒包括稳定表达人源大麻素受体CB1基因的单克隆细胞系CB1/SK-N-SH和ELISA检测试剂盒，所述对照组试剂盒包括空白对照细胞系Neo/SK-N-SH和ELISA检测试剂盒。本发明可实现所有大麻素类活性物质的精确、高灵敏的快速检测，无论是天然大麻素、还是合成大麻素，包括层出不穷的新型合成大麻素活性物质，可解决大麻类精神活性物质监

CN109856394B

CN109856394B权利要求书1/2页

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1.一种基于细胞多巴胺释放效应的大麻素类活性物质的检测方法，其特征在于包括以下步骤：

1)将人源大麻素受体CB1基因克隆到慢病毒表达载体pCDH-CMV-MCS-EF1-Neo的CMV启动子下，连接酶切位点为EcoRI和NotI,构建真核表达pCMV-CB1质粒；

2)将步骤1)pCMV-CB1质粒转染到神经母细胞瘤细胞，并建立CB1稳转的神经母细胞瘤细胞系，进行培养扩增得到检测组细胞培养液；同时以慢病毒表达载体pCDH-CMV-MCS-EF1-Neo为对照空载体，建立一个转染对照空载体的神经母细胞瘤细胞系，进行培养扩增得到对照组细胞培养液；

3)步骤2)检测组细胞培养液中加入四氢大麻酚并充分反应，配制一系列不同四氢大麻酚浓度的标准液；将标准液离心分离后，取上清液并用ELISA检测试剂盒检测多巴胺效应下的吸光度OD值，以测得的吸光度OD值为纵坐标，以标准液中的四氢大麻酚浓度为横坐标绘制标准曲线，计算拟合回归方程；

4)步骤2)检测组细胞培养液中加入待测样本，充分反应，离心分离后取上清液，对反应

后的检测组细胞培养液的上清液用ELISA检测试剂盒检测多巴胺效应下的吸光度OD?值；步骤2)对照组细胞培养液中加入待测样本，充分反应，离心分离后取上清液，对反应后的对照组细胞培养液的上清液用ELISA检测试剂盒检测多巴胺效应下的吸光度OD?值；计算吸光度OD?值与吸光度OD?值之差，并带入步骤3)回归方程，即可推算出待测样本中的大麻素类活性物质的效应含量；

步骤2)中，建立CB1稳转的神经母细胞瘤细胞系的过程为：将pCMV-CB1质粒、pH1质粒、pH2质粒共转染至慢病毒包装细胞293V,制备得到CMV-CB1慢病毒；将CMV-CB1慢病毒感染SK-N-SH细胞得到CB1/SK-N-SH稳转细胞，用含新霉素G418的条件培养基筛选CB1/SK-N-SH稳转细胞，并通过挑取克隆的方法获得稳定表达人源大麻素受体CB1基因的单克隆细胞系CB1/SK-N-SH。

2.如权利要求1所述的一种基于细胞多巴胺释放效应的大麻素类活性物质的检测方法，其特征在于步骤2)中，神经母细胞瘤细胞为SK-N-SH细胞。

3.如权利要求2所述的一种基于细胞多巴胺释放效应的大麻素类活性物质的检测方法，其特征在于步骤2)中，建立转染对照空载体的神经母细胞瘤细胞系的过程为：将pCDH-CMV-MCS-EF1-Neo对照空载体、pH1质粒、pH2质粒共转染至慢病毒包装细胞293V,制备得到空载体慢病毒；将空载体慢病毒感染SK-N-SH细胞得到Neo/SK-N-SH