CN110004179B 一种大麻素类活性物质的通用检测方法及其检测试剂盒 （浙江诺迦生物科技有限公司）.docxVIP

(19)国家知识产权局

(12)发明专利

(10)授权公告号CN110004179B(45)授权公告日2023.06.06

(21)申请号201910306031.2

(22)申请日2019.04.16

(65)同一申请的已公布的文献号申请公布号CN110004179A

(43)申请公布日2019.07.12

(73)专利权人浙江诺迦生物科技有限公司

地址311200浙江省杭州市萧山区萧山经

济技术开发区启迪路198号杭州湾信息港E座16楼

(72)发明人范春雷程向荣

(74)专利代理机构杭州浙科专利事务所(普通合伙)33213

专利代理师周红芳

(51)Int.CI.

C12N15/867(2006.01)

C12N15/12(2006.01)

CO7K14/705(2006.01)

G01N21/64(2006.01)

(56)对比文件

WO2019060316A1,2019.03.28CN104017827A,2014.09.03

EP2733205A1,2014.05.21审查员何春征

权利要求书2页说明书6页附图3页

(54)发明名称

FuraRed-

FuraRed-Cr黄光值copGFP焚光值

1.500

1.200

1.000

0300-

0.500

0.200

0.000

大麻吸食人员的毛发样本

CB1.copGFP/293细胞

copGFP293阴性对照细胞

(57)摘要

CN110004179B本发明公开了一种大麻素类活性物质的通用检测方法及其检测试剂盒，检测试剂盒分为检测组试剂和对照组试剂两种成分，检测组试剂包括稳定表达人源大麻素受体CB1基因的单克隆细胞系CB1·copGFP/293和细胞内游离钙离子检测荧光探针试剂FuraRed,对照组试剂包括空白对照单克隆细胞系copGFP/293和细胞内游离钙离子检测荧光探针试剂FuraRed;所述空白对照单克隆细胞系copGFP/293的制备方法为：将pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP质粒、pH1质粒、pH2质粒共转染至慢病毒包装细胞293V,制备EF1-copGFP慢病毒，将EF1-copGFP慢病毒感染人胚肾细胞293,得到空白对照单克隆细胞系copGFP/293.本发明通过检测胞质内游离钙离子浓度变化，以荧光钙的荧光值(Ca2+F)与copGFP的荧光值(PF)的比值

CN110004179B

CN110004179B权利要求书1/2页

2

1.一种大麻素类活性物质的通用检测方法，其特征在于包括以下步骤：

1)将大麻素受体基因CB1克隆到一个含有EF1启动表达荧光蛋白的载体的CMV启动子下，构建表达质粒；所述大麻素受体基因CB1为人源大麻素受体CB1基因，荧光蛋白为copGFP;

2)将步骤1)构建的带荧光蛋白基因的质粒转染到真核永生化细胞，并建立EF1-荧光蛋白基因稳转细胞系，进行培养扩增得到检测组培养液；同样建立转染空白对照质粒，建立空白对照EF1-荧光蛋白基因稳转细胞系，进行培养扩增得到对照组培养液；所述空白对照质粒为pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP质粒，建立空白对照EF1-荧光蛋白基因稳转细胞系的过程为：将pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP质粒、pH1质粒、pH2质粒共转染至慢病毒包装细胞293V,制备得到EF1-copGFP慢病毒，将EF1-copGFP慢病毒感染人胚肾细胞293,得到空白对照单克隆细胞系copGFP/293;

3)步骤2)检测组培养液中加入四氢大麻酚，配制一系列不同四氢大麻酚浓度的检测组标准液；检测组标准液中分别加入细胞内游离钙离子探针试剂，充分反应后，进行检测胞内荧光蛋白的荧光值PF和荧光钙离子的荧光值Ca2+F,以测得的荧光值Ca2+F/荧光值PF比值作为纵坐标，以四氢大麻酚的浓度为横坐标绘制标准曲线，计算拟合回归方程；

4)步骤2)检测组培养液和对照组培养液中分别加入待测样本，分别配制得到样本液和对照液，样本液中的待测样本浓度与对照液中的待测样本浓度相同；样本液和对照液中分别加入细胞内游离钙离子探针试剂，充分反应后，对反应后的样本液进行检测胞内荧光蛋白的荧光值PF?和荧光钙离子的荧光值Ca2+F?,对反应后的对照液进行检测胞内荧光蛋白的荧光值PF