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小麦胁迫应答基因TaCHP和TaDSU的功能研究

摘要

盐旱等非生物胁迫条件，植物通过磷脂等众多信号通路组成的胁迫应答网络产生应答反应。动物中甘油二酯（DAG）是重要的磷脂分子之一，但植物中还没发现其靶信号蛋白，因而DAG在植物中的调控机制还不清楚。胁迫应答涉及到大量蛋白质的修饰化改变，其中SUMO化能够稳定蛋白质。SUMO化是动态可逆的过程，但是去SUMO化在胁迫应答中的功能研究较少。小麦是重要的粮食作物，但它属于甜土植物，抗逆能力较差，愈发严重的盐旱逆境严重影响了作物产量，因而有必要挖掘抗逆相关基因、培育抗逆小麦品种。本实验室利用不对称体细胞杂交渐渗技术选育了小麦渐渗系耐盐抗旱新品种山融3号（SR3），它是亲本普通小麦济南177（JN177）的近等基因系，是挖掘抗逆相关基因的优良材料。本实验室前期鉴定了一个可能参与磷脂通路的小麦耐盐相关基因TaCHP。本实验室一方面分析了TaCHP与磷脂通路的相关性，另一方面克隆了一个催化蛋白质去SUMO化的SUMO蛋白酶基因TaDSU，初步分析了它在植物抗逆中的作用和生理基础。

关键词

小麦；TaCHP；TaDSU；胁迫应答；功能研究

一、引言

1.1研究背景

随着全球环境的恶化，非生物胁迫如盐害、干旱、低温等对农作物的生长和产量造成了严重的影响。小麦作为世界上最重要的粮食作物之一，其生产受到非生物胁迫的威胁日益加剧。提高小麦的抗逆性，对于保障全球粮食安全具有重要意义。植物在长期的进化过程中，形成了一系列复杂的机制来应对非生物胁迫。这些机制涉及到多个信号通路和基因的调控，其中磷脂信号通路和蛋白质修饰在植物胁迫应答中发挥着重要作用。

1.2研究目的

本研究旨在深入探究小麦胁迫应答基因TaCHP和TaDSU的功能，分析它们在植物应对非生物胁迫中的作用机制，为小麦抗逆育种提供理论基础和基因资源。通过对这两个基因的研究，有望揭示植物在非生物胁迫下的分子调控网络，为培育具有更强抗逆性的小麦新品种提供新的思路和方法。

二、材料与方法

2.1实验材料

本研究选用小麦品种山融3号（SR3）及其亲本济南177（JN177）作为实验材料。同时，使用拟南芥作为模式植物，用于基因功能验证和机制研究。所用的菌株和载体包括大肠杆菌DH5α、农杆菌GV3101、植物表达载体pCAMBIA3301等。

2.2实验方法

2.2.1基因克隆与鉴定

采用RT-PCR技术从小麦中克隆TaCHP和TaDSU基因的全长cDNA序列。通过生物信息学分析，对基因的结构、氨基酸序列、保守结构域等进行预测和分析。构建TaCHP和TaDSU基因的过表达载体和RNA干扰载体，并转化农杆菌。利用农杆菌介导的方法，将载体导入小麦和拟南芥中，获得转基因植株。

2.2.2基因表达分析

采用实时定量PCR技术，分析TaCHP和TaDSU基因在不同组织、不同发育阶段以及在盐、旱、ABA等胁迫处理下的表达模式。使用GUS组织化学染色法，观察TaCHP和TaDSU基因在转基因植株中的组织特异性表达。

2.2.3功能验证

对转基因小麦和拟南芥植株进行盐、旱等非生物胁迫处理，观察植株的生长状况，测定相关生理指标，如存活率、鲜重、干重、相对含水量、脯氨酸含量、丙二醛含量等，以验证TaCHP和TaDSU基因在植物抗逆中的功能。

2.2.4互作蛋白筛选与鉴定

利用酵母双杂交技术，筛选与TaCHP和TaDSU相互作用的蛋白。通过双分子荧光互补（BiFC）、荧光素酶互补成像（LCI）等方法，验证蛋白之间的相互作用。对互作蛋白进行功能分析，探讨它们在TaCHP和TaDSU介导的胁迫应答信号通路中的作用。

三、TaCHP基因的功能研究

3.1TaCHP基因的克隆与生物信息学分析

通过RT-PCR技术，从小麦山融3号中克隆得到TaCHP基因的全长cDNA序列。该基因开放阅读框长度为1236bp，编码一个含有411个氨基酸的蛋白质。生物信息学分析表明，TaCHP蛋白含有三个保守的C1结构域，属于锌指蛋白家族。TaCHP蛋白具有细胞核定位信号，推测其可能在细胞核中发挥作用。

3.2TaCHP基因的表达模式分析

实时定量PCR结果显示，TaCHP基因在小麦的根、茎、叶等组织中均有表达，其中在根中的表达量最高。在盐胁迫和干旱胁迫下，TaCHP基因的表达量显著下调；而在ABA处理下，TaCHP基因的表达量也呈现下降趋势。GUS组织化学染色结果表明，TaCHP基因在转基因拟南芥的根、茎、叶、花等组织中均有表达，且在根尖、叶脉等部位表达较强。

3.3TaCHP基因过表达提高