专题六--血红蛋白的提取与分离.pptVIP

;生产和生活中使用酶制剂和固定化酶，都需要把从微生物细胞中提取分离出来。

细胞中有许多种蛋白质，怎样才能将所需要的酶提取分离出来呢？;知识回顾--------有关蛋白质的几个问题：;细胞和生物体的结构物质，是一切生命活动的主要承担者。;①氨基酸间脱水缩合时，原来的氨基和羧基就不存在了，形成的化合物即多肽的一端只有一个氨基，另一端只有一个羧基（不计R基上的氨基和羧基）。所以对于一条多肽链说，至少应有的氨基和羧基都是一个;思考1分离生物大分子的基本思路是什么？;思考3高温灭菌和酒精灭菌分别利用蛋白质

的何种作用，作用结果是什么被破坏？;根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度和吸附的性质和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不同蛋白质。;1、凝胶色谱法的别名：分配色谱法

是根据相对分予质量的大小分离蛋白质的有效方法。;基础知识（一）凝胶色谱法;;;基础知识（一）凝胶色谱法;1、我们在什么地方遇到过缓冲物质的？

2、缓冲物质有哪些？

3、缓冲溶液的作用是什么？

4、怎样配制缓冲溶液？;①弱酸和弱酸盐组合;思考：

你认为在血红蛋白整个实验中用的缓冲液是什么？

它的目的是什么？;1、概念;基础知识（三）电泳;十二烷基硫酸钠（SDS）—聚丙烯酰胺凝胶电泳;SDS能使蛋白质发生完全变性。由几条肽链组成的蛋白质复合体在SDS的作用下会解聚成单条肽链，因此测定的结果只是单条肽链的分子量。SDS能与各种蛋白质形成蛋白质—SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有电荷量。因而掩盖了不同种蛋白质之间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。;为了消除静电荷对迁移率的影响可以在凝胶中加入()。SDS能使蛋白质发生完全变性。由几条肽链组成的蛋白质复合体在SDS的作用下会解聚成单条肽链，因此测定的结果只是()。SDS能与各种蛋白质形成蛋白质—SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有电荷量。因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于()。;影响蛋白质分子运动速度的因素;讨论：如何测定蛋白质的分子量？;实验操作;实验操作;血液;血液由血浆和各种血细胞组成，其中红细胞最多。在红细胞的组成中，约90％是血红蛋白。血红蛋白由四个肽链组成(如图)，包括两个α-肽链和两个β-肽链。其中每条肽链环绕一个亚铁血红素基团，此基团可携带一分子氧或一分了二氧化碳。血红蛋白因含有血红素而呈现红色。;每个肽链环绕一个亚铁血红素基团，此基团可携带一分子氧或一分子二氧化碳，血红蛋白因含有血红素而呈红色;1、红细胞的洗涤;1、速度越高和时间越长会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀达不到分离的效果。;红细胞的洗涤洗涤红细胞的目的是去除杂蛋白，以利于后续步骤的分离纯化。采集的血样要及时分离红细胞，分离时采用低速短时间离心，如500r／rain离心2min，然后用胶头吸管吸出上层透明的黄色血浆，将下层暗红色的红细胞液体倒入烧杯，再加入五倍体积的生理盐水(质量分数为0.9％的NaCl溶液)，缓慢搅拌10min，低速短时间离心，如此重复洗涤三次，直至上清液中没有黄色，表明红细胞已洗涤干净。;2.血红蛋白的释放;3.分离血红蛋白溶液;;取1mL的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300mL的物质的量浓度为20mmol/L的磷酸缓冲液中（pH为7.0），透析12h。;4.透析;阅读课本相关内容，了解凝胶色谱的操作过程。;实验操作（二）凝胶色谱操作;2．凝胶色谱柱的装填装柱前要将色谱柱垂直固定在支架上。因为干的凝胶和用缓冲液平衡好的凝胶的体积差别很大，因此装柱前需要根据色谱柱的内体积计算所需要的凝胶量。本实验使用的是交联葡聚糖凝胶。“G”表示凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围，75表示凝胶得水值，即每克凝胶膨胀时吸水7.59。凝胶用蒸馏水充分溶胀后，配成凝胶悬浮液，在与色谱柱下端连接的尼龙管打开的情况下，一次性缓慢倒入色谱柱内，装填时可轻轻敲动色谱柱，使凝胶装填均匀。注意色谱柱内不能有气泡存在，一旦发现有气泡，必须重装。装填完后，立即连接缓冲液洗脱瓶，在约50cm高的操作压下，用300mL的物质的量浓度为20mmol／L的磷酸缓冲液(pH为7.0)充分洗涤平衡凝胶12h，使凝胶装填紧密。;2.凝胶色谱柱的装填;3.凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙；