11第十一章：基因表达和功能研究.pptVIP

;;;基因转录过程：

无论是原核生物还是真核生物，转录过程都包括：模板识别、转录起始、转录的延伸和终止。

基因转录过程的研究包括以下问题：

一个转录本是否就是一个基因的准确的复制品，或者它还缺少DNA序列的部分。这些缺少的DNA片段被称为“内含子”（intron）。Intron的结构和可能的功能是非常让人感兴趣的。

除了基因内区外，转录的起始点和终止点的精确定位也很重要。大部分的转录体不仅仅是基因本身的复制品，而且还有位于基因两端的核苷酸序列的复制，即位于基因前面和后面的调控序列或信号序列。;;;;;环（Loop）;;;;单链核酸酶酶解法进行一些巧妙的改变之后，可以用于对转录的起始和终止点定位和对所有的基因内含子区的位置定位。

此操作的主要技术关键是：选择该基因（DNA片段）末端可被Sau3A切出的限制性片段，将其克隆到M13-载体中，得到其单链分子。;以含有300bp的位于该基因前的前导序列和100bp编码区的Sau3A-片段为例：将该限制性片段克隆到M13-载体后，将重组M13-载体与RNA-转录本混合，同转录本互补的一小段序列会形成双链结构，而M13-载体DNA-分子的其它部分还是单链的，S1处理时，重组M13-载体中基因与转录本杂交形成双链的部分会受到这个RNA-转录本的保护。除了这一段外，整个DNA都被S1酶解；随后，再用碱破坏DNA-RNA中的RNA后，就只保留下参与转录的一小段DNA-单链。通过图11-5可看出，这段保存下来的单链就是转录起点到右边的Sau3A识别位点之间的距离（因为转录本中包括这个转录起点）。通过电泳可确定这个单链片段的大小，并对转录起始位点在DNA序列上定位。;;用同样的方法，也可以确定转录末点、基因内含子区和基因外显子区的位置。

例如，在基因的起始片段之后再取一段，它的长度为300bp，将它克隆到单链的M13中并与该基因的mRNA杂交，并用S1酶切。电泳检查剩下的双链片段的长度，如果它为300bp长，则说明这段中还没有基因内含子区。如果它的长度为150bp，则说明在该段150bp处开始了基因内含子区序列（被S1切除了）。类似的操作可以确定出外显子的数目和位置。

其他研究RNA转录的技术还有RNA印迹??（Northernblotting）、RT-PCR、RACE法、RNA测序等，前面我们已介绍过。;;在生物体内，并非所有的基因都处于表达状态。

无论是低等生物还是高等生物，通常只有少数基因处于持续地表达状态，而大多数基因是受调控表达的：只有当细胞需要这种基因产物时，它们才被启动。

对于高等生物而言，基因的表达具有时空特性：不同的组织、细胞的基因表达存在差异；即使同一组织在不同的生长发育时期和生长发育状态下，其基因的表达也存在不同。;低等生物中，以大肠杆菌的色氨酸生物合成酶的基因表达为例：当色氨酸在细胞中大量存在时，该基因就被关闭；而当色氨酸浓度降低时就重新被激活。

在高等生物中，基因调控就更复杂，高等生物拥有更多的调控基因。

在基因的上游区域（即编码序列开始前）通常具有一个或几个调控序列（图11-9），调控蛋白（由调控基因编码）可附着于这些序列上，可调控该基因的表达（开启和关闭）。

调控蛋白既可以抑制也可以增强基因的表达：

调控蛋白的抑制作用可使基因表达减弱或停止；

调控蛋白的促进作用能使基因的表达被激活或增强。;;11.2.1基因的调控序列研究;A、凝胶阻滞实验（Gelretardationassay）

又叫DNA迁移率变动实验（DNAmobilityshiftassay），是在20世纪80年代初期出现的用于在体外研究DNA与蛋白质相互作用的一种特殊的凝胶电泳技术。它具有简单、快捷等优点，也是当前被选作分离纯化特定DNA结合蛋白质的一种典型的实验方法。

原理：DNA与蛋白的结合导致了电泳时迁移率的降低。;凝胶阻滞实验的基本原理图

放射性标记的DNA由于与一种细胞蛋白质B结合，于是在凝胶电泳中移动速度变慢，在放射自显影中呈现滞后的条带;;;;B、脱氧核糖核酸酶I（DNaseI）足迹法（foot-printing）;基本原理:一段DNA，当它和一个调控蛋白结合后，调控序列范围内被保护起来，而不会被核酸内切酶如DNaseI分解（图11-12）。;方法：对要研究的DNA片段在一端用一个放射性基团进行标记，并使它与调控蛋白结合成复合体（图11-13），然后，加入DNaseI。使用的DNaseI的量要适当，以便使DNA-片段并不完全被分解，而使每一个分子中间仅在一处被切开。在没有蛋白质结合的部位，每个碱基处都有被切开的可能。这样我们就得到