基因表达调控-第三课-mRNA水平的研究.pptVIP

mRNA分析技术;;基因表达的变化可以两个水平进行分析：mRNA水平

和蛋白质水平;一、RNA研究策略和方法;TotalRNA：rRNA约占80％-85％，tRNA和核内小分子RNA约占10%-15%，mRNA约占1%-5%，琼脂糖凝胶电泳中只能看到：28S，18S，5S。;RNA浓度和纯度检测

A260/A280表示质量（一般在1.8-2.0），A260表示数量。;（二）RT-PCR（半定量PCR）;RT-PCR相关试剂;反转录引物;1．防止RNA的降解，保持RNA的完整性。

2.避免gDNA的污染，用DNase处理。

3．为了防止非特异性扩增，必须设阴性对照。

4．内参的设定：主要为了用于靶RNA的定量。常用的内参有GAPDH、β-Actin等。其目的在于避免RNA定量误差、加样误差以及各PCR反应体系中扩增效率不均一各孔间的温度差等所造成的误差。

5.稀释cDNA，内参循环数20-26。

6.扩增产物长度300-500bp。;（三）Real-timePCR实时定量PCR;引物设计原则;7.3′端不要以A结尾，3′端不可修饰，而且要避开AT,GCrich

的区域，避开T/C,A/G连续结构（2-3个）。

8.引物3′端要避开密码子的第3位。

9.荧光定量产物长度80-150bp最好，最长是300bp.

10.最好跨内含子。

11.引物与非特异性扩增序列的同源性最好小于70％。

12.TM值在55-63度之间。;DNA或RNA的绝对定量分析，包括病原微生物或病毒含量的检测，转基因动植物转基因拷贝数的检测，RNAi基因失活率的检测等。

基因表达差异分析，例如比较经过不同处理样本之间特定基因的表达差异(如药物处理、物理处理、化学处理等)，特定基因在不同时相的表达差异以及cDNA芯片或差显结果的确证。

基因分型，例如SNP检测，甲基化检测等。;B;定量PCR引物设计软件：;将待检的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，继而按照同Southern?blot相同的原理进行转膜和用探针进行杂交检测。

Northernblot主要用于检测样品中是否含有基因的转录产物（mRNA）及其含量。

;Northernblot流程图;Northernblot;优点：northernblot的灵敏度要好于基因芯片实验，而基因芯片优势在于

它可在一次实验中同时反映出几千个基因表达量的变化；

与定量PCR的高灵敏度相比，northernblot较高的特异性可以有效

的减少实验结果的假阳性。

缺点：Northernblot实验中要防止RNA的降解，所有实验用品都需要经

过除去RNA酶的过程，如高温烘烤、DEPC处理等。同时，

northernblot中很多实验用品如甲醛、EB、DEPC、紫外灯等对人

体都有一定的伤害。;（五）核糖核酸酶保护实验

（ribonucleaseprotectionassay，RPA）

是灵敏度和特异性很高的mRNA定量分析方法

基本原理：

将标记的特异RNA探针（32P或生物素）与待测的RNA样品液相杂交，标记的特异RNA探针与目的RNA结合，形成双链RNA，免受RNA酶的消化；而未结合的单链RNA经RNA酶A或RNA酶T1消化形成寡核糖核酸。;RPA基本程序：;核糖核酸酶保护实验原理示意图;RPA比NorthernBlot的优势：;可对细胞或组织中原位表达的mRNA进行区域定位

标记探针特异性地与目标靶mRNA序列杂交，检测标记信号来确定基因在组织和细胞内表达的区位信息。

可作为定量分析的补充。;原位杂交技术主要步骤：;（七）差异表达基因筛选方法;转录抑制剂：

actinomycinD(ActD),放线菌素D

5,6-dichloro-1–D-ribofuranosyl-benzimidazole(DRB),

α-amanitin(α-Am);荧光素酶报告基因分析系统;二、mRNA稳定性调节的机制;AU-richelements(AREs):AUUUA,7-9%ofcellularmRNAs;（2）Regulatorynon-codingRNA;（3）Alternativepolyadenylation(APA);MostmRNAregulatoryelementsaresituatedwithinthe5’and3’untranslatedregions(