福林Folin-酚试剂法测定.pptVIP

一、原理蛋白质或多肽分子中有带酚基酪氨酸或色氨酸，在碱性条件下，可使酚试剂中的磷钼酸化合物还原成蓝色（生成钼蓝和钨蓝化合物）。蓝色的深浅与蛋白质的含量成正比，可用比色法测定。二、实验仪器1.卵清蛋白片2.7220分光光度计3.试管4.移液管三、实验试剂1.Folin-酚试剂A：碱性铜溶液甲液：取Na2CO32g溶于100ml0.1mol/l氢氧化钠溶液中乙液：取CuSO4.5H2O晶体0.5g，溶于1%酒石酸钾100ml中。临用时按甲：乙=50：1混合使用。2.Folin-酚试剂B：将100g钨酸钠、25g钼酸钠、700ml蒸馏水、50ml85%磷酸继100ml浓盐酸置于1500ml的磨口圆底烧瓶中，充分混匀后，接上磨口冷凝管，回馏10小时，再加入硫酸锂150g，蒸馏水50ml及液溴数滴，开口煮沸15分钟，在通风橱内驱除过量的溴。冷却，稀释至1000ml，过滤，滤液成微绿色，贮于棕色瓶中。临用时，用1mol/l的氢氧化钠溶液滴定，用酚酞作指示剂，根据滴定结果，将试剂稀释至相当于1mol/L的酸。3.1mg/mL牛血清蛋白液：称取1g牛血清蛋白片溶于0.9%氯化钠溶液中，并稀释至1000ml四、实验步骤1.标准曲线的绘制取7支干燥的试管，编号，按下表加入试剂，比色后，以光密度为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标作图。2.样品测定准确吸取样液0.5ml于干燥的试管中，同样按下表加入试剂，测出光密度值后，对照标准曲线求出样液的蛋白质浓度。管号1234567样品牛血清蛋白液(1mg/ml)ml蒸馏水mlFolin-酚试剂A00.54.00.050.454.00.10.44.00.20.34.00.30.24.00.40.14.00.504.00.5（样液）04.0摇匀，在室温下放置10分钟Folin-酚试剂B0.50.50.50.50.50.50.50.5摇匀，在室温下放置30分钟后在500nm下比色OD500蛋白质含量测定的方法有哪些，各有什么优缺点？下次试验：氨基酸纸层析和维生素C定量测定-2，6，二氯酚靛酚法。附：7200型分光光度计的操作程序连接仪器电源线，确定仪器供电电源有良好的接地性能。接通电源，使仪器预热20分钟。用MODE键设置测试方式：投射比（T），吸光度（A），已知标准样品浓度值方式（C）和已知标准样品斜率（F）方式。用波长选择旋钮设置您所需的分析波长。将参比样品溶液和被测样品溶液分别倒入比色皿中，打开样品室盖，将盛有溶液的比色皿分别插入比色皿槽中，盖上样品室盖。一般情况下，参比样品放在第二个槽位中。将0％T校具（黑体）置入光路中，在T方式下按“0％T”键，此时显示器显示“000.0”按MODE键选择A模式将参比样品拉入光路中，按“0A/100％T”键调0A/100％T，此时显示器显示的“BLA”直至显示“0.000”A为止。当仪器显示器显示出“0.000”A后，将被测样品推入光路，这时，您便可从显示器上得到被测样品的吸光度。分光光度计的使用注意事项:比色皿的清洁程度，直接影响实验结果。因此，特别要将比色皿清洗干净。装样前处理：自来水反复冲洗→蒸馏水漂洗2次→待装溶液漂洗2次。用完后用自来水和蒸馏水洗净并用檫镜纸檫干放回比色皿盒中。拿放比色皿时，应持其“毛面”，不要接触“光面”。光面毛面若比色皿外表面有液体，应用擦镜纸朝同一方向拭干，以保证吸光度测量不受影响。