CN118726475B 核酸、重组载体、靶向整合细胞、基因表达方法和应用 （深圳太力生物技术有限责任公司）.docxVIP

(19)国家知识产权局

(12)发明专利

(10)授权公告号CN118726475B(45)授权公告日2025.07.08

(21)申请号202311493439.8

(22)申请日2023.11.09

(65)同一申请的已公布的文献号申请公布号CN118726475A

(43)申请公布日2024.10.01

(66)本国优先权数据

202310347496.92023.03.28CN

(73)专利权人深圳太力生物技术有限责任公司地址518017广东省深圳市福田区福保街

道福保社区海红道1号综合信兴一期三层323-M号

(72)发明人陈亮杨小丽李文峥林隆志兰万军梁国龙

(74)专利代理机构北京华夏正合知识产权代理事务所(普通合伙)11017

专利代理师韩登营

(51)Int.CI.

C12N15/85(2006.01)

C12N15/65(2006.01)

C12N15/90(2006.01)

C12N5/10(2006.01)

(56)对比文件

佚名.Cricetulusgriseusunplaced

genomicscaffold,CriGri_1.0

scaffold5086,wholegenomeshotgun

sequenceNCBIReferenceSequence:NW_

003616785.1.Genbank数据库.2020,0RIGIN部分.

审查员杜鹏飞

权利要求书2页说明书18页序列表(电子公布)附图6页

(54)发明名称

核酸、重组载体、靶向整合细胞、基因表达方法和应用

(57)摘要

CN118726475B本申请涉及生物技术领域，特别是涉及核酸以及含有其的重组载体、靶向整合细胞及生产目标基因表达产物的方法和其应用。所述核酸包含SEQIDNo.1所示的核酸片段，所述核酸片段用于整合外源核酸片段。本申请前期经过大量的细胞株筛选，发现对如SEQIDNo.1所示的核酸片段或者与其保持至少90%一致性的同源片段，将

CN118726475B

通过随机整合将筛序标记表达RMCE盒引入CHO宿主中单克隆化扩增

筛选高筛选标记、低拷贝数宿主单克隆

标记基因细胞稳定性评估

稳定、高筛选标记细胞进行产品评估

产品基因通过同源重组与宿主中筛选标记表达RMCE盒进行序列交换

证明宿主整合位点为产品高表达、稳定位点

候选宿主细胞株进行测序等方法获取该整合位点信息

CN118726475B权利要求书1/2页

2

1.重组载体，其特征在于，所述重组载体包括核酸，所述核酸包含SEQIDNo.1所示的核酸片段，所述核酸片段整合有外源核酸片段；

所述外源核酸片段包括目标基因和/或选择标记基因，所述目标基因和/或选择标记基因整合在SEQIDNo.1所示的核酸的NW_003616785.1:83044位点；

所述外源核酸片段还包含第一重组识别序列和第二重组识别序列；所述第一重组识别序列为与SEQIDNo.1所示的核酸片段所存在的序列片段同源的5同源臂；所述第二重组识别序列为与SEQIDNo.1所示的核酸片段所存在的序列片段同源的3同源臂；

所述重组载体靶向中国仓鼠卵巢CHO细胞。

2.根据权利要求1所述的重组载体，其特征在于，所述外源核酸片段为目标基因；所述第一重组识别序列为与SEQIDNo.1所示的核酸片段所存在的序列片段同源的5同源臂；所述第二重组识别序列为与SEQIDNo.1所示的核酸片段所存在的序列片段同源的3同源臂；或，

所述外源核酸片段为选择标记基因；所述第一重组识别序列为与SEQIDNo.1所示的核酸片段所存在的序列片段同源的5同源臂；所述第二重组识别序列为与SEQIDNo.1所示的核酸片段所存在的序列片段同源的3同源臂。

3.根据权利要求2所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体为慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、疱疹病毒载体、痘病毒载体、杆状病毒载体、乳头瘤病毒载体、乳头多瘤空泡病毒载体、整合性噬菌体载体、非病毒载体、转座子和/或转座酶、整合酶底物或者质粒。

4.根据权利要求1至3任一项所述的重组载体，其特征在于，所述选择标记基因选自新霉素抗性基因、胸苷激酶基因、潮霉素磷酸转移酶基因、二氢叶酸还原酶基因、胸苷激酶基因、谷氨酰胺合成酶基因、