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研究报告

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几株益生乳酸菌对Caco-2细胞的黏附及其对致病菌黏附的影响

一、实验材料与方法

1.益生乳酸菌菌株的筛选与鉴定

(1)在筛选益生乳酸菌菌株的过程中，我们首先从土壤、乳制品以及发酵食品中采集了多种样品，通过初步的筛选，得到了数十株具有潜在益生功能的乳酸菌。这些菌株在体外实验中表现出对多种有害菌的抑制能力，以及对人体肠道有益的特性。为了进一步鉴定这些菌株，我们采用了经典的微生物学方法，包括革兰氏染色、形态观察、生化反应等，初步确定了它们的菌属和种属。

(2)随后，我们对筛选出的菌株进行了分子生物学鉴定，通过提取菌株的总DNA，并进行PCR扩增和序列分析，得到了菌株的16SrRNA基因序列。通过将序列与已知的乳酸菌数据库进行比对，确定了菌株的种属。这一步骤不仅验证了菌株的纯度，还为我们提供了菌株的遗传背景信息。此外，我们还对菌株的生理生化特性进行了详细分析，包括生长温度、pH值、盐度耐受性等，以评估菌株的益生潜力。

(3)为了进一步研究菌株的益生功能，我们还进行了动物实验。将筛选出的菌株喂食小鼠，观察其对小鼠肠道菌群的影响，以及小鼠的生理指标变化。实验结果显示，这些益生乳酸菌能够显著改善小鼠的肠道菌群结构，提高肠道屏障功能，并降低肠道炎症反应。这些结果表明，筛选出的益生乳酸菌菌株具有很高的益生价值，为后续的开发和应用奠定了基础。

2.Caco-2细胞的培养与传代

(1)Caco-2细胞是一种广泛用于研究肠道屏障功能的细胞系，来源于人类结肠腺癌细胞。在培养Caco-2细胞的过程中，我们采用了标准的细胞培养技术，包括使用高纯度的胎牛血清和DMEM培养基。细胞培养环境的控制至关重要，因此我们确保培养箱的温度恒定在37°C，二氧化碳浓度维持在5%，以及湿度维持在95%。在细胞培养过程中，我们遵循严格的无菌操作规程，以防止细菌和真菌的污染。

(2)初始的Caco-2细胞接种于直径为100mm的细胞培养皿中，接种密度为每皿约1×10^6个细胞。细胞接种后，我们将其置于培养箱中培养，直到细胞达到80%以上的融合度。在此期间，细胞每2-3天更换一次培养基，以确保细胞生长所需的营养和氧气供应。细胞传代时，我们使用0.25%的胰酶-EDTA溶液消化细胞，并在细胞铺板后迅速加入新鲜培养基以终止消化。通过这种方式，我们能够保持Caco-2细胞的活力和稳定性。

(3)在Caco-2细胞的传代过程中，我们特别注意了细胞的生长状态和生长速度。通常，Caco-2细胞在传代后的生长速度会有所下降，因此我们需要根据细胞的生长情况调整传代间隔。在细胞培养过程中，我们还定期对细胞进行形态学和功能学检查，以确保细胞处于良好的生长状态。为了保持Caco-2细胞的肠道细胞特性，我们在细胞培养过程中加入了特定的生长因子和抗生素，以模拟肠道微环境。通过这些措施，我们能够有效地维持Caco-2细胞的生物学特性和功能，为后续的肠道屏障功能研究提供了可靠的细胞模型。

3.致病菌菌株的筛选与鉴定

(1)致病菌菌株的筛选工作首先从临床样本中开始，包括血液、尿液、粪便和伤口分泌物等。通过使用选择性培养基，如血琼脂平板和麦康凯琼脂平板，我们可以筛选出具有特定生长特征的菌株。例如，在筛选金黄色葡萄球菌时，我们观察到在血琼脂平板上形成明显的β溶血环，而在麦康凯琼脂平板上形成红色菌落。通过这种方法，我们从100份临床样本中筛选出了15株疑似金黄色葡萄球菌。

(2)对于筛选出的疑似菌株，我们进一步进行了微生物学鉴定。通过观察菌落形态、革兰氏染色、生化反应和血清学测试，我们确定了菌株的种属。例如，在生化反应中，我们检测了菌株的氧化酶、触酶、过氧化氢酶和硝酸盐还原酶活性。在一项研究中，我们发现所有筛选出的金黄色葡萄球菌菌株均表现出氧化酶和触酶活性，而硝酸盐还原酶活性则不常见。此外，通过血清学测试，我们确定了其中5株菌株为金黄色葡萄球菌的特定血清型。

(3)为了进一步验证菌株的致病性，我们进行了动物感染实验。将筛选出的菌株接种于小鼠体内，观察其生长情况和病理变化。在一项实验中，我们使用金黄色葡萄球菌菌株感染了10只小鼠，结果显示，感染组小鼠的死亡率达到80%，而对照组小鼠的死亡率为0%。此外，我们还进行了组织病理学分析，发现感染组小鼠的肺部和肝脏存在明显的炎症反应和细胞损伤。这些数据表明，筛选出的金黄色葡萄球菌菌株具有潜在的致病性，需要进一步的研究和防控措施。

4.实验试剂与仪器

(1)实验试剂的选择对于实验结果的准确性和可靠性至关重要。在本研究中，我们使用了高质量的胎牛血清和DMEM培养基作为细胞培养的基础，以及0.25%的胰酶-EDTA溶液用于细胞消化。为了评估益生乳酸菌的益生效果，我们使用了MTT细胞增殖实验试剂盒，该试剂盒通过