纯化水、注射用水微生物检验方法确认.docVIP

VP-JY-0026-01

纯化水、注射用水微生物检验方法学验证方案

PagePAGE2ofNUMPAGES15

验证文件

纯化水、注射用水微生物检验方法学验证方案

（VP）

文件编号：VP-JY-0026-01

项目名称：纯化水、注射用水微生物检验方法学验证

项目

部门

职务

签名

日期

起草人

质量管理部

化验员

年月日

审核人

质量管理部

中心化验室主任

年月日

审核人

质量管理部

质量管理部经理

年月日

批准人

验证领导小组

质量副总经理

年月日

目录

根据《中国药典》2015版四部1105项下微生物检查法的规定，验证纯化水、注射用水微生物检查方法的适用性，即确认检品、所设定的检验条件及检验程序对供试品中可能存在的各类微生物无抑制作用,其方法可行有效。

4.2适用范围

适用于纯化水、注射用水微生物检验方法学验证。

5验证内容

培养基在使用前应进行适用性的检查，合格后方可进行，通过R2A琼脂培养基上的菌落与营养琼脂对照培养基和TSA对照培养基上的菌落比较，以确认所采用方法的可行性。

5.1培养基的制备

取适用性检查合格的R2A琼脂培养基按照15.2g加入1000ml纯化水的比例进行配制，加热使其完全溶解，分装于的锥形瓶中,装量不得超过容器的三分之二，盖塞，用无菌布包扎好后进行湿热灭菌121℃、15min，灭菌后PH值7.2±0.2。冷却后放入2～8℃冰箱备用。

5.2菌种

铜绿假单胞菌〔CMCC（B）10104〕

金黄色葡萄球菌〔CMCC（B）26003〕

枯草芽孢杆菌〔CMCC（B）63501〕

白色念珠菌〔CMCC（F）98001〕

黑曲霉〔CMCC（F）98003〕

使用以上各种菌株传代次数均不得超过5代

5.3菌液的制备：

接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至胰酪大豆胨液体培养基上，30～35℃培养18～24小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至沙氏葡萄糖液体培养基上，20～25℃培养2～3天，上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数10～100CFU（菌落形成单位）的菌悬液。接种黑曲霉的新鲜培养物至沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基上，20～25℃培养5～7天，加入3～5ml含0.05％（v/v）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05％（v/v）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数10～100CFU的孢子悬液。

菌悬液在室温下放置应在2小时内使用，若保存在2～8℃可在24小时内使用。

5.4菌液的计数：（每种菌液每种培养基接种2个平皿）

5.2.2.1分别接种铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌至培养皿，每皿接种1ml菌液（10～100cfu），倾注TSA对照培养基，凝固后于30～35℃倒置培养不超过5天。营养琼脂对照培养基、R2A琼脂培养基方法同TSA对照培养基。

5.2.2.2分别接种白色念珠菌2皿，每皿接种1ml菌液（10～100cfu），倾注胰酪大豆胨琼脂对照培养基，凝固后于30～35℃倒置培养不超过5天。

5.2.2.3用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液将黑曲霉制成每1ml含孢子数10～100cfu的孢子悬液。取1ml菌液至胰酪大豆胨琼脂对照培养基30～35℃培养不超过5天。

5.4薄膜过滤法检测微生物

5.4.1制备平皿

取在2～8℃冰箱中保存的培养基，微波炉溶化后按标准操作程序传至微生物限度检查室，待培养基冷却至50℃左右浇注平皿（每皿30±2ml，注意培养皿不得破裂，装量应相同，尽量避免形成气泡）。

5.4.2水样的检测

取纯化水5ml加入灭菌纯化水50ml薄膜过滤，按照标准操作规程进行水样微生物的检测后，取膜置于R2A琼脂培养基，在30～35℃恒温培养箱进行培养5天。

取注射用水100ml薄膜过滤，按照标准操作规程进行水样微生物的检测后，取膜置于R2A琼脂培养基，在30～35℃恒温培养箱进行培养5天。

5.4.3对照样品

另取含菌数10～100CFU的铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉1ml加入滤杯内，分别取纯化水、注射用水同上操作过膜后，取膜置于R2A琼脂培养基，在30～35℃恒温培养箱进行培养5天。TSA对照培养基和营养琼脂对照培养基上方法同R2A琼脂培养基。

5.4.4阴性