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脂肪酶活检测原理及实际方法：

一、原理以及标准曲线做法

1.对硝基苯酚酯（4-Nitrophenylester）是脂肪酶水解活力测定中运用最为广泛的一种

底物，脂肪酶水解其产生pNP（对硝基苯酚）在碱性条件下显黄色，在410nm下有吸光值，且灵敏度很高。

2.所需试剂有：

CAS碳链长度出货号价格名称

830-03-5????C2????N8130-1G￥462????对硝基苯乙酸酯

2635-54-9C4??N9876-1G??￥570对硝基苯丁酸酯

1956-10-1???C8????21742-1G-F￥487对硝基苯辛酸酯

1956-11-2C12???61716-1G￥435对硝基苯月桂酸酯

1492-30-4???C16N2752-1G￥379对硝基苯棕榈酸酯

14617-86-8???C18???N3627-1G??￥2621.97对硝基苯硬酸脂

全部为色谱纯试剂，购于sigma公司

标准曲线绘制：

a.标准对硝基苯酚母液(2mM，2mmol/L):

称取0.02789g的对硝基苯酚(p-NP)溶于100ml的溶液B（即不同pH的缓冲液），置于棕色试剂瓶内，4℃冰箱保存。

方法一：

b.标准曲线绘制：

分别取0.02，0.04，0.06，0.08，0.12，0.16ml的对硝基苯酚母液(2mM)，用溶液B（即不同pH的缓冲液）稀释至4ml，分别测定在410nm处的吸收值。以对硝基苯酚浓度x（对应浓度分别是0.01，0.02，0.03，0.04，0.06，0.08，单位：mM）为横坐标，吸光值y为纵坐标，绘制标准曲线。

方法二：全部对硝基苯酚经过与测酶活相同的处理，获得吸光度。

b.标准曲线的绘制：

分别取0、1.875、3.75、7.5、15、22.5、30、45μL的对硝基苯酚分别加入62.5、60.625、58.75、55、47.5、40、32.5、17.5μL的异丙醇和（全部都是）562.5的溶液B，40℃15min，95%乙醇，10000r/min，3min，测出标准曲线。

上表是方法一测得标准曲线

脂肪酶酶活定义：在410nm下测定吸光值,以1min内催化水解底物对硝基苯棕榈酸酯(p-NPP)产生1μmol对硝基苯酸(p-NP)所需的酶量为1个酶活单位(U)。

公式y=14.474x+0.0272中x是p-NP的浓度(单位：mmol/l)，y是吸光值，14.474、0.0272是反应系数，R2是相关系数。则，酶活计算公式为：

酶活=1000*n*V*(y-0.0272)/14.474t其中n为稀释倍数，t为反应时间（单位：min），V为反应体系的总体积（单位：L）、1000是mmol到μmol的比例。

底物耐碱性测定及试验液配制

底物耐碱性测定

a.6种底物分别加至pH7，pH8的37℃的PBS缓冲液中（选择37℃培养箱），每隔5min检测一次颜色变化，拍照；

b.6种底物分别加至pH8，pH9的Tris-HCl缓冲液中（37℃），每隔5min检测一次颜色变化，拍照；

c.分别加至pH9，pH10的Gly-NaOH缓冲液。

测酶活所需要试剂的配制，酶活测定方法

方法一：（96孔板法，粗略，速度快）

溶液的配制

溶液A：溶液A:30.0mg对硝基苯棕桐酸脂(p-NPP，Sigma，或者其他底物，337.52g/mol，即8.89*10-5mol)溶于10.00ml异丙醇（浓度为8.89*10-3M，或8.89mM），4℃棕色瓶（可以使用包锡箔纸的15ml离心管）保存，每10ml可用于单个酶500次测定；

溶液B:缓冲液(pH缓冲液，可更改)100.0ml加入1滴TritonX-100，混匀，4℃保存。

96孔板（220μL）：

A液（底物液）：18μL

↗

体系液180（μL）+酶液（40μL）

↘

B液（pH缓冲液）：162μL

此步骤中，底物再次被稀释，浓度为0.889mM。

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A

C230空白

C230平行

C430空白

C430

C830空白

C830

C1230空白

C1230

C1630空白

C1630

B

C230平行

C230平行

C