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基因工程优化马克思克鲁维酵母：解锁高温高产木糖醇与乙醇新路径

一、引言

1.1研究背景与意义

随着全球经济的快速发展，能源需求持续增长，传统化石能源的有限性和环境问题日益凸显，开发可再生、可持续的能源成为当务之急。乙醇作为一种重要的生物能源，具有清洁、可再生等优点，被广泛应用于燃料、化工等领域。将乙醇调入汽油作为车用燃料（E型汽油），能够优化油品性能和质量，显著降低一氧化碳、碳氢化合物等主要污染物的排放，在生物能源领域，其作为化石燃料替代者的潜力备受关注。目前乙醇生产方式主要有工业生产和微生物生产。工业生产主要通过乙烯与水合成，但乙烯大量取自石油裂解气，不仅受石油资源限制，还需高温高压条件，导致成本高昂且环境污染严重。相比之下，微生物发酵糖类生产乙醇是一种利用再生资源的绿色生产方法，既能满足燃料等方面的需求，又可避免环境污染，因此越来越受到青睐。

木糖醇是一种五碳多元醇，是木糖代谢的正常中间产物，在食品、医药等行业有着不可或缺的应用价值。在食品行业，木糖醇的甜味与蔗糖相当，可作为甜味剂使用，且口感清凉，还因其不能被口腔内酵母菌和细菌利用，能够预防龋齿，常被用作儿童防蛀食品的添加剂。同时，由于木糖醇是微生物的不良培养基，可作为食品添加剂延长食品保鲜期。在医药领域，木糖醇用于静脉滴注时，无需胰岛素促进即可透过细胞膜，增加肝糖元，为细胞提供能量，同时降低血液中丙酮酸、乳酸和葡萄糖的含量，且无细胞毒性，可作为糖尿病患者的辅助治疗试剂。目前木糖醇的生产主要采用工业生产的化学加氢法，该方法需要高温高压条件，生产成本高，工艺复杂且收率低，限制了木糖醇的大规模生产。此外，加氢过程需镍催化，存在食品安全隐患并会造成环境污染。基于此，微生物法生产木糖醇应运而生，该方法利用细胞内的木糖还原酶（XR）将木糖还原为木糖醇，无需镍催化，确保了食品安全且无环境污染。反应所需的氢来自细胞内的还原性辅酶和氢离子，无需另行制氢，且在常温常压下进行，成本较低。同时，由于酶的底物专一性，原料无需高度精制。因此，微生物法生产木糖醇具有污染少、成本低、产品质量高的优势，发展前景广阔。

马克思克鲁维酵母（Kluyveromycesmarxianus）作为一种具有独特优势的微生物，在发酵领域展现出巨大潜力。它是一种GRAS（generallyregardedassafe）酵母，广泛存在于乳制品、葡萄酒发酵制造中，对环境、动物及人类安全无害。该酵母能够在较高温度下生长，最高可在52°C生长，且生长速率较高（0.86-0.99h/40°C）。在高温下发酵具有诸多优点，首先，高温发酵可降低发酵过程中的冷却费用；其次，纤维素酶等的最适催化温度较高，高温能提高以淀粉、纤维素等生物质为原料的同步糖化发酵（SSF）效率，促进糖化，减少酶的使用成本；最后，能在耐热范围内生存的微生物较少，高温发酵可降低污染风险。此外，马克思克鲁维酵母具有很高的代谢多样性，能利用多种工业上的底物糖类生长发酵，使其成为替代酿酒酵母进行工业发酵和外源蛋白表达的有力候选者，在生物能源生产领域的应用也越来越广泛。

然而，野生型马克思克鲁维酵母在高温条件下生产木糖醇和乙醇的能力仍有待提高，无法满足工业化大规模生产的需求。通过基因工程技术对马克思克鲁维酵母进行改造，能够优化其代谢途径，提高相关酶的活性和表达量，增强其对底物的利用效率和耐受性，从而实现高温高产木糖醇和乙醇。这不仅有助于降低生产成本，提高生产效率，还能推动生物能源和食品工业的可持续发展，对于缓解能源危机和满足市场对木糖醇的需求具有重要的现实意义。因此，本研究致力于通过基因工程改造马克思克鲁维酵母实现高温高产木糖醇和乙醇，具有重要的理论和实际应用价值。

1.2国内外研究现状

在利用微生物生产木糖醇和乙醇的研究中，国内外学者针对不同的微生物菌株和发酵条件开展了大量工作。在木糖醇生产方面，微生物法因其具有诸多优势成为研究热点。早期研究主要集中在筛选能够利用木糖生产木糖醇的微生物菌株，如假丝酵母属（Candida）、毕赤酵母属（Pichia）等。随着研究的深入，基因工程技术逐渐应用于木糖醇生产菌株的改造。有研究通过克隆和表达木糖还原酶基因，提高了菌株将木糖转化为木糖醇的能力。例如，将来自热带假丝酵母（Candidatropicalis）的木糖还原酶基因导入酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）中，成功构建了能够生产木糖醇的工程菌株。

在乙醇生产领域，利用微生物发酵糖类生产乙醇的研究也取得了显著进展。传统的酿酒酵母虽然是常用的乙醇生产菌株，但它不能利用木糖。为了解决这一问题，研究者们将目光转向能够利用木糖发酵生产乙醇的菌株，如树干毕赤酵母（Pichiastipitis）和休哈塔假丝酵母（Candidasheha