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基于转基因荧光斑马鱼模型的化妆品中雌激素检测方法

1范围

本方法规定了采用Tg(5×ERE:GFP)转基因荧光斑马鱼试验体系开展化妆品

中禁用雌激素类物质的检测方法，适用于液态水基类、啫喱类、乳液类等常见剂

型化妆品中违禁雌激素的定性检测。

2规范性引用文件

GB/T34713-2017化学品体外毒性试验替代方法的验证程序和原则

GB/T30649-2020实验动物实验鱼质量控制

3术语及定义

下列术语及定义适用于本文件。

3.1斑马鱼Zebrafish

本方法使用的斑马鱼，经过人工繁育，对其遗传、微生物、寄生虫、饲料和

环境实施进行控制，是一种用于科学实验的模式动物。

3.2受精后小时Hourspost-fertilization

生物学术语，受精卵受精后的小时数，Hourspost-fertilization，hpf。

4试验原理

雌激素可与雌激素受体（EstrogenReceptor,ER）发生特异性结合，形成雌激

-受体复合物；该复合物可进一步结合下游雌激素反应元件（EstrogenResponse

Element,ERE），启动下游绿色荧光蛋白（GreenFluorescentProtein,GFP）的转

录与翻译过程。因此，当外源雌激素存在时，通过荧光体式显微镜可观察到绿色

荧光信号强度显著增强。

在本研究采用的Tg(5×ERE:GFP)转基因雌激素荧光斑马鱼模型中，GFP的

表达具有组织特异性，主要定位于肝脏及心脏组织。基于此，受试物暴露后，可

通过检测该模型肝脏与心脏区域的荧光表型，定性判断受试物中雌激素类物质的

存在与否；同时，以荧光信号的阳性/阴性响应率为核心指标，可进一步评估该

转基因斑马鱼模型对复杂基质样品的检测适用性。

5主要试剂和材料

5.1斑马鱼品系

Tg(5×ERE:GFP)转基因荧光斑马鱼。

5.2斑马鱼培养液

参照《ZebrafishBook》Eggwater（5.0mmol/LNaCl、0.17mmol/LKCl、0.33mmol/L

CaCl₂、0.33mmol/LMgSO₄，pH7.4）。

5.3二甲基亚砜（DMSO）：Dimethylsulfoxide，CAS号：67-68-5。

5.4阳性对照受试物（10ng/L的炔雌醇）：Ethinylestradiol，CAS号：57-63-6

称取0.0060g炔雌醇，加入600μLDMSO溶解后得到母液为10μg/μL的母

液，吸取1μL母液（10μg/μL），加入至含适量稀释液（Eggwater）的1.5mL

离心管中，用稀释液定容至1mL，涡旋混匀，得到第一级储备液（浓度为

4

10μg/mL），吸取1μL第一级储备液，转移至新的1.5mL离心管，用稀释液定

4

容至1mL，涡旋混匀，得到第二级储备液（浓度为10ng/mL），吸取1μL第二

级储备液，转移至新的1.5mL离心管，用稀释液定容至1mL，涡旋混匀，得到

第三级储备液，浓度为10ng/mL，吸取10μL第三级储备液（10ng/mL），转移

至10mL容量瓶中。用标准稀释水定容至10mL刻度线，颠倒混匀，即得到终浓

度为10ng/L的工作液。

5.5羧甲基纤维素钠（CMC-Na）：Sodiumcarboxymethylcellulose，CAS号：

9004-32-4。

用电子天平称取3.5gCMC-Na于500mL烧杯中，加入100mL预热的双蒸

水，加热搅拌过夜，使CMC-Na与水充分混匀，直至呈透明状，转移到玻璃试

剂瓶中，放入4℃冰箱中储存备用。

5.60.4%丙基硫氧嘧啶（PTU）：Propylthiouracil，CAS号：51-52-5。

用电子天平精密称取PTU粉末0.4g，放入玻璃试剂瓶中，用PBS溶液充分

溶解并定容至100mL，若不溶可放入超声波清洗机中稍加超声溶解，置于常温

中储存即可，使用时需稀释100倍，即终浓度为0.004%。

6主要仪器和设备

6.1斑