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MSTNRNAi和FSTN过表达基因转移体的构建

一、材料与方法

（一）材料

菌株与载体：大肠杆菌DH5α感受态细胞、pSilencer4.1-CMVneo载体（用于构建MSTNRNAi载体）、pcDNA3.1(+)载体（用于构建FSTN过表达载体）。

酶与试剂：限制性内切酶（如BamHⅠ、HindⅢ等）、T4DNA连接酶、DNA聚合酶、琼脂糖凝胶电泳相关试剂、质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒等。

引物：根据MSTN基因序列设计特异性RNAi引物，根据FSTN基因CDS序列设计扩增引物，引物由专业公司合成。

模板：含有MSTN基因和FSTN基因的cDNA文库。

（二）方法

MSTNRNAi载体的构建

（1）引物设计与合成：根据MSTN基因的保守序列，设计2对特异性的siRNA序列，分别命名为siRNA1和siRNA2。并在引物两端引入与pSilencer4.1-CMVneo载体对应的酶切位点（如BamHⅠ和HindⅢ）。

（2）PCR扩增：以含有MSTN基因的cDNA为模板，使用设计好的引物进行PCR扩增，获得MSTN基因的干扰片段。PCR反应体系为：模板DNA1μL，上下游引物各1μL，DNA聚合酶0.5μL，dNTPs2μL，10×PCRbuffer5μL，ddH?O40.5μL，总反应体积50μL。反应条件：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃终延伸10min。

（3）酶切与连接：将PCR扩增得到的干扰片段和pSilencer4.1-CMVneo载体分别用BamHⅠ和HindⅢ进行双酶切。酶切反应体系为：DNA片段/载体10μL，10×酶切buffer2μL，两种限制性内切酶各1μL，ddH?O6μL，37℃水浴酶切3h。酶切产物经琼脂糖凝胶电泳后，用胶回收试剂盒回收目的片段和载体骨架。然后用T4DNA连接酶将回收的干扰片段与载体骨架连接，连接反应体系为：载体骨架4μL，目的片段6μL，T4DNA连接酶1μL，10×连接buffer1μL，16℃连接过夜。

（4）转化与筛选：将连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，具体操作如下：取5μL连接产物加入50μL感受态细胞中，冰浴30min；42℃热激90s，迅速冰浴2min；加入500μLLB液体培养基，37℃、180r/min振荡培养1h；取100μL菌液涂布于含有氨苄青霉素（Amp?）的LB固体培养基上，37℃培养过夜。挑取单菌落接种于含Amp?的LB液体培养基中，37℃、180r/min振荡培养过夜，提取质粒，进行酶切鉴定和测序验证。

FSTN过表达载体的构建

（1）引物设计与合成：根据FSTN基因的CDS序列，设计上游引物和下游引物，上游引物引入BamHⅠ酶切位点，下游引物引入XhoⅠ酶切位点。

（2）PCR扩增：以含有FSTN基因的cDNA为模板，使用设计好的引物进行PCR扩增，获得FSTN基因的完整CDS片段。PCR反应体系和反应条件同MSTNRNAi载体构建中的PCR扩增。

（3）酶切与连接：将PCR扩增得到的FSTNCDS片段和pcDNA3.1(+)载体分别用BamHⅠ和XhoⅠ进行双酶切，酶切反应体系和条件同前。回收目的片段和载体骨架后，用T4DNA连接酶连接，连接反应体系和条件同前。

（4）转化与筛选：将连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，操作步骤同前，涂布于含Amp?的LB固体培养基上培养。挑取单菌落培养后提取质粒，进行酶切鉴定和测序验证。

重组载体的鉴定

（1）酶切鉴定：将提取的重组质粒用相应的限制性内切酶进行酶切，琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物，若出现预期大小的目的片段和载体骨架片段，则初步鉴定为阳性克隆。

（2）测序验证：将酶切鉴定阳性的重组质粒送专业测序公司进行测序，将测序结果与目的基因序列进行比对，若序列一致，则表明重组载体构建成功。

二、结果与分析

（一）MSTNRNAi载体的构建结果

PCR扩增结果：以含有MSTN基因的cDNA为模板进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳显示，在预期大小（约200bp）处出现特异性条带，与设计的干扰片段大小相符，表明成功扩增出MSTN基因的干扰片段。

酶切鉴定结果：对重组的pSilencer4.1-MSTN-siRNA载体进行BamHⅠ和HindⅢ双酶切，电泳结果显示出