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微生物检验中菌落总数的不确定度评定

一、引言：为何关注菌落总数的不确定度？

在微生物检验领域，菌落总数作为评估样品卫生质量、污染程度以及判断消毒效果的关键指标，其结果的可靠性与准确性至关重要。然而，由于微生物本身的特性（如分布不均、易受环境影响、生长繁殖的随机性）以及检验过程的复杂性（涉及样品采集、稀释、接种、培养、计数等多个环节），菌落总数的测定结果不可避免地存在一定的分散性和不确定性。

不确定度评定，作为表征合理地赋予被测量之值的分散性、与测量结果相联系的参数，能够科学地量化这种不确定性，为检验结果的解释、比较和应用提供更为全面的信息。它不仅是实验室质量控制和质量保证的重要组成部分，也是提升检测数据可信度、增强实验室间结果可比性的有效手段。因此，对微生物检验中菌落总数进行不确定度评定，具有重要的理论与实践意义。

二、不确定度的基本概念与微生物检验的特殊性

（一）不确定度的定义与内涵

根据国际计量局（BIPM）等组织联合发布的《测量不确定度表示指南》（GUM），不确定度是指“根据所用到的信息，表征赋予被测量量值分散性的非负参数”。它不同于误差，误差是测量结果与真值之差，而真值往往难以获知；不确定度则是对测量结果可能存在的误差范围的估计，是对测量结果质量的定量表征。

（二）微生物检验中不确定度的特殊性

微生物检验，尤其是菌落总数的测定，其不确定度评定较化学分析等领域更为复杂和特殊。主要体现在：

1.微生物的活体细胞特性：微生物是具有生命活动的个体，其数量和活性易受温度、湿度、营养、氧气等多种因素影响，导致测量结果具有更大的变异性。

2.分布的不均匀性：样品中微生物的空间分布通常是不均匀的，这使得代表性取样和后续的稀释过程成为引入不确定度的重要来源。

3.计数的离散性：菌落计数本质上是一种计数过程，其结果服从特定的概率分布（如泊松分布），计数本身就带有随机性误差。

4.培养条件的敏感性：不同的培养温度、时间、培养基成分等都会影响微生物的生长和菌落的形成，从而引入不确定性。

因此，在进行菌落总数不确定度评定时，必须充分考虑这些微生物检验特有的因素。

三、菌落总数不确定度评定的基本步骤

菌落总数不确定度的评定过程，通常遵循GUM推荐的通用步骤，但需结合微生物检验的特点进行具体应用。

（一）明确被测量与测量方法

首先需清晰定义被测量，即菌落总数（CFU/g或CFU/mL等）。同时，详细描述所采用的标准检验方法，因为不同的方法可能导致不同的不确定度来源和大小。例如，采用平板计数法，其不确定度来源与MPN法会有显著差异。

（二）识别不确定度来源

这是不确定度评定中最为关键也最具挑战性的一步。对于菌落总数测定，主要的不确定度来源可归纳为以下几个方面：

1.样品相关因素：

*样品的代表性与均匀性：取样过程是否随机，样品本身微生物分布是否均匀。

*样品的运输与储存：运输和储存条件是否恰当，是否导致微生物数量变化。

2.实验操作过程因素：

*稀释过程：稀释液体积的准确性（移液枪/移液管的准确度、重复性）、稀释倍数的计算、稀释操作的混匀效果。

*接种过程：接种体积的准确性（如倾注法中培养基温度对体积的影响，涂布法中移液器的准确性）。

*培养过程：培养温度的控制精度、培养时间的准确性、培养基的质量与批次差异、培养箱内温度的均匀性。

3.计数过程因素：

*计数的重复性：不同操作人员或同一操作人员不同时间对同一样品的计数差异。

*计数界限的判断：如对微小菌落、蔓延菌落、链状菌落的计数规则掌握。

*计数工具的影响：如菌落计数器的清晰度。

4.仪器与试剂因素：

*仪器校准：如天平、移液器、培养箱、温度计等的校准状态及其不确定度。

*试剂质量：如稀释液的无菌性、pH值，培养基的促生长能力、无菌性。

5.数据处理与计算因素：

*计算公式的近似：如当菌落数较少时，泊松分布向正态分布转换的近似。

*有效数字的取舍。

在识别过程中，可以通过鱼骨图、因果图等工具系统梳理，确保不遗漏主要来源。

（三）不确定度分量的量化（A类与B类评定）

对于识别出的每一个不确定度来源，都需要对其引起的不确定度分量进行量化。

*A类评定：通过对观测列进行统计分析来评定不确定度。例如，对同一份均匀样品进行多次独立的平行测定（包括从稀释到计数的完整过程），利用实验标准偏差来表征重复性引入的不确定度分量。对于计数过程本身的离散性，可根据泊松分布特性，取计数结果N的平方根作为其标准不确定度（u(N)=√N）。

*B类评定：基于经验、资料或其他信息的概率分布估算不确定度。例如，根据移液管的校准证书给出的最大允许误差（MPE），假设其服从均匀分布，则其标准不确定度为MPE/