基于UPLC-MS_MS技术精准检测人体生物样本中Etheno-DNA加合物的方法学探索.docxVIP

基于UPLC-MS/MS技术精准检测人体生物样本中Etheno-DNA加合物的方法学探索

一、引言

1.1研究背景与意义

DNA作为承载遗传信息的关键物质，其结构完整性和稳定性对细胞的正常功能和生物体的健康至关重要。然而，DNA时刻面临着内源性和外源性因素的威胁，其中氧化损伤是最为常见的一种。Etheno-DNA加合物作为DNA氧化损伤的产物之一，由环氧乙烷、1,2-二氯乙烷等环境污染物以及乙醇代谢产物等引发形成。这些加合物的出现会破坏DNA的正常结构和功能，进而增加细胞发生突变和癌变的风险。众多研究表明，Etheno-DNA加合物与多种癌症的发生发展密切相关，例如肝癌、肺癌等。因此，准确检测Etheno-DNA加合物对于癌症的早期诊断、病情监测以及治疗效果评估都具有举足轻重的意义，它能够为癌症的防治提供关键的科学依据。

目前，检测Etheno-DNA加合物的方法主要有气相色谱-质谱法、高效液相色谱-荧光法等。气相色谱-质谱法在分析样品时需要对其进行衍生化处理，这一过程不仅复杂繁琐，还容易导致样品在前处理阶段出现损失，从而影响检测结果的准确性；高效液相色谱-荧光法虽然操作相对简便，但灵敏度有限，难以检测出低浓度的Etheno-DNA加合物，并且在复杂生物样本中容易受到其他物质的干扰，导致检测结果的可靠性降低。这些传统方法普遍存在样品处理复杂、灵敏度欠佳、检测时间长以及成本高昂等问题，无法满足当前对Etheno-DNA加合物高精度、高效率检测的需求。

超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱（UPLC-MS/MS）技术凭借其独特的优势，在生物分析领域得到了广泛的应用。该技术融合了超高效液相色谱的高分离效率和三重四极杆串联质谱的高灵敏度、高选择性，能够在较短的时间内实现对复杂生物样本中痕量物质的准确分离和定量分析。开发基于UPLC-MS/MS的Etheno-DNA加合物检测方法，有望突破现有检测技术的瓶颈，为深入研究Etheno-DNA加合物与人体健康的关系提供强有力的技术支持，对于推动癌症等疾病的早期诊断和预防具有重要的现实意义。

1.2国内外研究现状

在Etheno-DNA加合物检测领域，国内外学者进行了大量的研究工作。早期，32P-后标记法凭借其较高的检测灵敏度（可达1个加合物/109个核苷酸的水平），在该领域占据重要地位。然而，该方法存在诸多缺陷，如DNA酶解过程操作繁杂，不同种类和结构的加合物标记效率差异较大，依赖复杂的色谱法进行分离导致分离过程耗时久、工作量大且自动化程度低，检测特异性差，难以有效区分结构相似的DNA加合物等。

免疫分析法利用抗原-抗体的特异性结合原理进行检测，具有操作相对简便的优点，但容易受到交叉反应的干扰，导致检测结果的准确性受到影响。荧光测定法虽然具有一定的灵敏度，但在复杂生物样本中的选择性较差，容易受到背景荧光的干扰。

气相色谱-质谱法（GC-MS）需要对样品进行衍生化处理，这增加了样品处理的复杂性和误差来源，且在检测低浓度加合物时灵敏度有限。高效液相色谱-荧光法（HPLC-FLD）操作相对简便，但灵敏度和选择性难以满足复杂生物样本中痕量Etheno-DNA加合物的检测需求。

近年来，液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）因其前处理方法相对简单、稳定性好、选择性强、灵敏度高等优点，逐渐成为Etheno-DNA加合物检测的研究热点。国外一些研究团队利用LC-MS/MS技术，对不同生物样本中的Etheno-DNA加合物进行了检测，并取得了一定的成果。国内相关研究也在不断跟进，致力于优化检测方法，提高检测的灵敏度和准确性。

UPLC-MS/MS作为LC-MS/MS的升级技术，具有更高的分离效率和灵敏度。目前，UPLC-MS/MS在Etheno-DNA加合物检测领域的应用研究尚处于发展阶段，但已展现出巨大的潜力。通过优化色谱和质谱条件，能够实现对生物样本中痕量Etheno-DNA加合物的快速、准确检测。未来，随着技术的不断发展和完善，UPLC-MS/MS有望成为Etheno-DNA加合物检测的主流方法，为相关领域的研究提供更加可靠的技术支持。

1.3研究目标与内容

本研究旨在建立一种高效、灵敏的UPLC-MS/MS检测方法，用于准确测定人体生物样本（如血液、尿液）中的Etheno-DNA加合物。具体研究内容如下：

标准品的制备：合成3N4-o-2’-dcoxycytidine（adC）加合物作为外标，同时合成稳定同位素标记的【15N5】1,N6-etheno-2’-osine和【15N3】3N4