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附件4

化妆品中金黄色葡萄球菌的检验方法（征求意见稿）

DetectionofStaphylococcusAureusinCosmetics

1范围

本规范规定了化妆品中金黄色葡萄球菌的检验方法。

本规范适用于化妆品中金黄色葡萄球菌的检验。

2定义

金黄色葡萄球菌Staphylococcusaureus

为革兰氏阳性球菌，呈葡萄状排列，无芽胞，无荚膜，能发酵甘露醇，血浆凝固酶阳性。

3菌种

序号

菌株名称

菌株编号

菌株来源

1

金黄色葡萄球菌

CMCC(B)26003，或其他等效标准菌株

中国医学细菌保藏管理中心

注：用于适用性试验和检验过程中的质量控制

4仪器和设备

4.1显微镜。

4.2恒温培养箱：36±1℃。

4.3天平：0~200g，精确至0.1g。

4.4灭菌刻度吸管：10mL、1mL。

4.5试管：18mm×150mm。

4.6载玻片。

4.7酒精灯。

4.8三角瓶：250mL、150mL、100mL。

4.9高压灭菌器。

4.10恒温水浴箱。

4.11无菌平皿。

4.12离心机。

5培养基和试剂

5.1SCDLP液体培养基

见总则附录。

5.2营养肉汤

成分：蛋白胨 10g

牛肉浸粉 3g

氯化钠 5g

蒸馏水加至 1000mL

制法：将上述成分加热溶解，调pH至7.4±0.2，分装，121℃高压灭菌15min。

5.37.5%氯化钠肉汤

成分：蛋白胨 10g

牛肉浸粉 3g

氯化钠 75g

蒸馏水加至 1000mL

制法:将上述成分加热溶解，调pH至7.4±0.2，分装，121℃高压灭菌15min。

5.4BairdParker平板

成分：胰蛋白胨 10g

牛肉浸粉 5g

酵母浸膏 1g

丙酮酸钠 10g

甘氨酸 12g

氯化锂(LiCl?6H2O) 5g

琼脂 20g

蒸馏水 950mL

增菌剂的配制：30%卵黄盐水50mL与除菌过滤的1%亚碲酸钾溶液10mL混合，保存于冰箱内。

制法：将各成分加到蒸馏水中，加热煮沸完全溶解，冷至25±1℃，调节pH至7.0±0.2。分装每瓶95mL，121℃高压灭菌15min。临用时加热溶化琼脂，冷至50℃，每95mL加入预热至50℃左右的卵黄亚碲酸钾增菌剂5mL，摇匀后倾注平板。培养基应是致密不透明的。使用前在冰箱贮存不得超过48±2h。

5.5血琼脂平板

成分：营养琼脂 100mL

脱纤维羊血(或兔血) 10mL

制法：将营养琼脂加热融化，待冷至50℃左右无菌操作加入脱纤维羊血，摇匀，制成平板，置冰箱内备用。

5.6甘露醇发酵培养基

成分：蛋白胨 10g

氯化钠 5g

甘露醇 10g

牛肉浸粉 5g

0.2%麝香草酚蓝溶液 12mL

蒸馏水 1000mL

制法：将蛋白胨、氯化钠、牛肉膏加到蒸馏水中，加热溶解，调pH至7.4±0.2，加入甘露醇和指示剂，混匀后分装试管中，68.95kPa(115℃10lb)20min灭菌备用。

5.7灭菌液体石蜡

见总则附录。

5.8兔（人）血浆制备

取3.8%柠檬酸钠溶液，121℃高压灭菌30min，1份加兔（人）全血4份，混匀静置；2000~3000rpm离心3~5min，血球下沉，取上面血浆。

6操作步骤

6.1增菌培养：取1:10检液10mL接种到90mLSCDLP液体培养基中，置36±1℃培养箱，培养24~48h。

注：如无此培养基也可用7.5%氯化钠肉汤。

6.2分离培养：自上述增菌培养液中，取1~2接种环，划线接种到BairdParker平板培养基上，置36±1℃培养24~48h。如无此培养基也可划线接种到血琼脂平板，置36±1℃培养18~24h。在血琼脂平板上菌落呈金黄色（有时为白色），圆形，不透明，表面光滑，周围有溶血圈。在BairdParker平板培养基上典型菌落为圆形，光滑，凸起，湿润，颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为一混浊带，在其外层有一透明带。用接种针接触菌落似有奶油树胶的软度。偶然会遇到非脂肪溶解的类似菌落，但无混浊带及透明带。挑取单个菌落分纯在血琼脂平板上，置36±1℃培养18~24h。

6.3染色镜检：挑取血琼脂平板上分纯后的菌落，涂片，进行革兰氏染色