化妆品中洋葱伯克霍尔德菌群的检验方法.docxVIP

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附件6

化妆品中洋葱伯克霍尔德菌群的检验方法（征求意见稿）

DetectionofBurkholderiacepaciaComplexinCosmetics

1范围

本规范规定了化妆品中洋葱伯克霍尔德菌群的检验方法。

本规范适用于化妆品中洋葱伯克霍尔德菌群的检验。

2定义

洋葱伯克霍尔德菌群Burkholderiacepaciacomplex

属于伯克霍尔德菌属（Burkholderia），为需氧非发酵的革兰氏阴性杆菌，借助极鞭毛进行运动。由多种表型近似，但基因型存在差异的菌种组成，代表菌种为洋葱伯克霍尔德菌。

3菌种

序号

菌株名称

菌株编号

菌株来源

1

洋葱伯克霍尔德菌

CMCC(B)23015，或其他等效标准菌株

中国医学细菌保藏管理中心

2

新洋葱伯克霍尔德菌

CMCC(B)23014，或其他等效标准菌株

中国医学细菌保藏管理中心

注：用于适用性试验和检验过程中的质量控制。

4设备和材料

4.1恒温培养箱：36±1℃。

4.2三角瓶：150mL、200mL、250mL。

4.3试管。

4.4灭菌平皿：直径90mm。

4.5无菌吸管：1mL(具0.01mL刻度）、10mL(具0.1mL刻度）或者移液器及吸头。

4.6显微镜。

4.7载玻片。

4.8接种针、接种环。

4.9电磁炉。

4.10高压灭菌器。

4.11恒温水浴箱。

4.12天平：感量0.01g。

5培养基和试剂

5.1SCDLP液体培养基

见总则中附录。

5.2洋葱伯克霍尔德菌选择性琼脂培养基（BCSA）

成分：胰蛋白胨 10g

酵母浸粉 1.5g

蔗糖 10g

乳糖 10g

氯化钠 5g

酚红 0.08g

结晶紫 2mg

庆大霉素 0.01g

万古霉素 2.5mg

多粘菌素B 600000U

琼脂 14g

蒸馏水 1000mL

制法：除琼脂、庆大霉素、万古霉素和多黏菌素B外，取上述成分混合，微温溶解，调pH为6.8±0.2，加入琼脂，加热融化后，121℃高压灭菌15min后，冷却至45~50℃加入庆大霉素、万古霉素和多粘菌素B，混匀，倾注平板。

5.3氧化酶试剂

成分：四甲基对苯二胺盐酸盐 1.0g

蒸馏水 100mL

制法：使用前取上述成分溶于蒸馏水中。

5.4赖氨酸脱羧酶试验培养基

成分：蛋白胨 5.0g

酵母浸粉 3.0g

葡萄糖 1.0g

溴甲酚紫 0.02g

蒸馏水 1000mL

L-赖氨酸或DL-赖氨酸 5.0g或10.0g

制法：除赖氨酸以外的成分加入蒸馏水中，搅匀后加热溶解，加入L-赖氨酸或DL-赖氨酸，对照培养基不加赖氨酸。必要时调节pH。分装后115℃高压灭菌15min。灭菌后的培养基在25℃的pH为6.8±0.2。

5.5西蒙氏枸橼酸盐培养基

成分：氯化钠 5g

硫酸镁（MgSO4.7H2O） 0.2g

磷酸二氢铵（NH4H2PO4） 1.0g

磷酸氢二钾（K2HPO4） 1.0g

柠檬酸钠 5.0g

琼脂 20.0g

0.2%溴麝香草酚蓝溶液 40.0mL

蒸馏水 1000mL

制法：将盐类溶于水中，调节pH为6.8±0.2，加入琼脂，加热融化后加入过滤后的溴麝香草酚蓝溶液，混合均匀，分装试管，121℃高压灭菌15min，制成斜面备用。

5.6胰酪大豆胨琼脂培养基（TSA）

见总则中附录。

6操作步骤

6.1增菌培养：用无菌吸管吸取1:10检液10mL，注入90mLSCDLP液体培养基中，置36±1℃培养48~72h。

6.2分离培养：用接种环取SCDLP增菌液一环，划线接种于BCSA琼脂平板，于36±1℃培养48~72h。典型菌落在BCSA琼脂平板上为灰白、灰粉色或土黄（棕）色，菌落周围培养基由黄色变橘红或玫红色。

6.3纯化：挑取可疑菌落划线接种于胰酪大豆胨琼脂（TSA），于36±1℃培养48~72h。

6.4染色镜检：挑取可疑菌落进行革兰氏染色，镜检为革兰氏阴性杆菌者应进行后续试验。

6.5氧化酶实验：挑取可疑菌落涂布于浸湿的氧化酶试剂滤纸条上，滤纸变为蓝色或紫红色为阳性。反应时间2~10min后才为阳性，为迟缓型氧化酶阳性。洋葱伯克霍尔德菌群为阴性或迟缓型氧化酶阳性。

6.6赖氨酸脱羧酶试验：挑取可疑菌落接种于赖氨酸脱羧酶试验培养基和对照培养基中,混匀后滴加一层无菌液体石蜡进行密封。36±1℃培养48~72h,观察结果。