化妆品中耐热大肠菌群的检验方法.docxVIP

附件3

化妆品中耐热大肠菌群的检验方法（征求意见稿）

DetectionofThermotolerantColiformBacteriainCosmetics

1范围

本规范规定了化妆品中耐热大肠菌群的检验方法。

本规范适用于化妆品中耐热大肠菌群的检验。

2定义

耐热大肠菌群Thermotolerantcoliformbacteria

系一群需氧及兼性厌氧革兰氏阴性无芽孢短杆菌，在44.5℃培养24~48h能发酵乳糖产酸并产气。

该菌主要来自人和温血动物粪便，可作为粪便污染指标来评价化妆品的卫生质量，推断化妆品中有否污染肠道致病菌的可能。

3菌种

序号

菌株名称

菌株编号

菌株来源

1

大肠埃希氏菌

CMCC(B)44102或其他等效标准菌株

中国医学细菌保藏管理中心

注：用于适用性试验和检验过程中的质量控制。

4设备和材料

4.1恒温水浴箱或恒温培养箱，44.5±0.5℃，36±1℃

4.2温度计。

4.3显微镜。

4.4载玻片。

4.5接种环。

4.6电磁炉。

4.7三角瓶：250mL。

4.8试管：18mm×150mm。

4.9小倒管。

4.10pH计或pH试纸。

4.11高压灭菌器。

4.12灭菌刻度吸管：10mL、1mL。

4.13灭菌平皿：直径90mm。

5培养基和试剂

5.1双倍乳糖胆盐(含中和剂)培养基

成分：蛋白胨 40g

猪胆盐 10g

乳糖 10g

0.4%溴甲酚紫水溶液 5mL

卵磷脂 2g

吐温80 14g

蒸馏水 1000mL

制法：将卵磷脂、吐温80溶解到少量蒸馏水中。将蛋白胨、胆盐及乳糖溶解到其余的蒸馏水中，加到一起混匀，调pH到7.4±0.2，加入0.4%溴甲酚紫水溶液，混匀，分装试管，每管10mL(每支试管中加一个小倒管)。115℃高压灭菌20min。

5.2单倍乳糖胆盐(含中和剂)培养基

将双倍乳糖胆盐(含中和剂)培养基配制体积加倍，其余配制相同。

5.3伊红美蓝(EMB)琼脂

成分：蛋白胨 10g

乳糖 10g

磷酸氢二钾 2g

琼脂 15g

2%伊红水溶液 20mL

0.5%美蓝水溶液 13mL

蒸馏水 1000mL

制法：在1000mL蒸馏水中加入磷酸氢二钾、蛋白胨和乳糖，混匀，使之溶解。校正pH值为7.1±0.2。再加入琼脂，121℃高压灭菌15min。冷至60℃左右无菌操作加入灭菌的2%伊红水溶液和0.5%美蓝水溶液，摇匀。倾注平皿备用。

6操作步骤

6.1初发酵试验

取10mL1:10稀释的检液，加到10mL双倍乳糖胆盐(含中和剂)培养基中，置36±1℃培养箱中培养24±2h，如既不产酸也不产气，继续培养至48±2h。如既不产酸也不产气，则报告为耐热大肠菌群阴性。

6.2复发酵试验

如认为初发酵存在基质效应无法判定或试验产酸且/或产气，则从上述培养管中取1mL,加到10mL单倍乳糖胆盐(含中和剂)培养基中，置44.5±0.5℃培养箱中培养24±2h。如既不产酸也不产气、只产酸或只产气，则报告为耐热大肠菌群阴性。

6.3可疑菌落分离

如复发酵试验产酸且产气，可划线接种到伊红美蓝琼脂平板上，置36±1℃培养18~24h。经培养后，在上述平板上观察有无典型菌落生长。耐热大肠菌群在伊红美蓝琼脂培养基上的典型菌落呈深紫黑色，圆形，边缘整齐，表面光滑湿润，常具有金属光泽。也有的呈紫黑色，不带或略带金属光泽，或粉紫色，中心较深的菌落，亦常为耐热大肠菌群，应注意挑选。

6.4染色镜检

挑取上述可疑菌落，参考总则5.3涂片作革兰氏染色镜检。典型菌落形态为革兰氏阴性无芽孢短杆菌

7结果报告

根据复发酵试验产酸且产气，平板上有典型菌落，并经证实为革兰氏阴性无芽孢短杆菌，则可报告被检样品中检出耐热大肠菌群。

化妆品中耐热大肠菌群的检验方法（征求意见稿）

起草说明

为加强化妆品的监督管理，进一步提高化妆品使用安全性，国家药监局化妆品标准化技术委员会组织开展了化妆品中耐热大肠菌群检验方法的研究和修订工作。现就工作有关情况说明如下：

起草原则

本标准规定了化妆品中耐热大肠菌群的检验方法，适用于市面上常见的化妆品品类。为保证评价方法的科学性，本次验证在样品选择上涵盖了市场上常见的化妆品类别，同时组织3家实验室进行协作验证，充分考量了实测数据的可靠性、重复性和准确性。

起草过程

化妆品标准化技术委员会于2023年11月委托开展了《化妆品安全技术规范》（以下简称《规