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附件2

化妆品中菌落总数的检验方法（征求意见稿）

AerobicPlateCountinCosmetics

1范围

本规范规定了化妆品中菌落总数的检验方法。

本规范适用于化妆品中菌落总数的测定。

2定义

菌落总数Aerobicplatecount

化妆品检样经过处理，在一定条件下（如培养基、培养温度和培养时间等）培养后，所得每g（mL）检样中形成的微生物菌落总数。

测定菌落总数便于判明检样被微生物污染的程度，是对检样进行卫生学总体评价的综合依据。

3菌株

序号

菌株名称

菌株编号

菌株来源

1

大肠埃希菌

CMCC(B)44102，或其他等效标准菌株

中国医学细菌保藏管理中心

2

金黄色葡萄球菌

CMCC(B)26003，或其他等效标准菌株

中国医学细菌保藏管理中心

3

枯草芽孢杆菌

CMCC(B)63501，或其他等效标准菌株

中国医学细菌保藏管理中心

注：用于适用性试验和检验过程中的质量控制。

4仪器和设备

4.1三角瓶：150mL、250mL。

4.2量筒：200mL。

4.3pH计或精密pH试纸。

4.4高压灭菌器。

4.5试管：18mm×150mm。

4.6灭菌平皿：直径90mm。

4.7灭菌刻度吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或者移液器及吸头。

4.8酒精灯。

4.9恒温培养箱：36±1℃。

4.10放大镜或/和菌落计数器。

4.11恒温水浴箱。

5培养基、冲洗液及试剂

5.1卵磷脂吐温80-营养琼脂培养基

成分：蛋白胨20g

牛肉浸粉3g

氯化钠5g

琼脂15g

卵磷脂1g

吐温807g

蒸馏水1000mL

制法：先将卵磷脂加到少量蒸馏水中，加热溶解，加入吐温80，将其他成分（除琼脂外）加到其余的蒸馏水中，溶解。加入已溶解的卵磷脂、吐温80，混匀，加入琼脂，调pH值使灭菌后为7.2±0.2，121℃高压灭菌15min。

5.2pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液

成分：磷酸二氢钾3.56g

无水磷酸氢二钠5.77g

氯化钠4.30g

蛋白胨1.00g

蒸馏水1000mL

制法：称取上述成分，微温溶解，必要时滤过使澄清，分装，121℃高压灭菌15min。

根据检样的特性，可选用其他经验证的适宜溶液作为冲洗液（如：生理盐水）。如需要，可在上述冲洗液灭菌前或灭菌后加入表面活性剂或中和剂等。

5.30.5%氯化三苯四氮唑（2,3,5-triphenylterazoliumchloride,TTC）

成分：TTC0.5g

蒸馏水100mL

制法：溶解后过滤除菌，或115℃高压灭菌20min，装于棕色试剂瓶，置4℃冰箱备用。

6操作步骤

6.1样品稀释

用灭菌吸管吸取1:10的检液1mL注入到9mL稀释液（灭菌生理盐水或其他含中和剂的稀释液）中（注意勿使吸管接触液面），并充分混匀，制成1:100检液。样品至少需进行1:10和1:100稀释，如样品含菌量高，还可再稀释成1:1000、1:10000、……等，每个稀释度应换1支吸管。

6.2平板计数方法

6.2.1平板倾注法

用灭菌吸管吸取1:10稀释的检液2mL，分别注入到两个灭菌平皿内，每皿1mL，将融化并冷却至44~48℃的卵磷脂吐温80-营养琼脂培养基倾注到平皿内，每皿加入15~20mL，随即转动平皿，使样品与培养基充分混合均匀，待琼脂凝固后，翻转平板，置36±1℃培养箱内培养48±2h。

为便于区别化妆品中的颗粒与菌落，可在每100mL卵磷脂吐温80-营养琼脂中加入0.1mL0.5%的TTC溶液，如有细菌存在，培养后的菌落呈橙红色，而化妆品中的颗粒颜色无变化。

6.2.2薄膜过滤法

抑菌性较强的检样，若性质允许，可