化妆品中霉菌和酵母菌的检验方法.docxVIP

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附件5

化妆品中霉菌和酵母菌的检验方法（征求意见稿）

DetectionofMoldandYeastinCosmetics

1范围

本规范规定了化妆品中霉菌和酵母菌数的检验方法。

本规范适用于化妆品中霉菌和酵母菌数的测定。

2定义

霉菌和酵母菌数MoldandYeastCount

化妆品检样经过处理，在一定条件下（如培养基、培养温度和培养时间等）培养后，所得每g（mL）检样中形成的霉菌和酵母菌总数，藉以判明化妆品被霉菌和酵母菌污染的程度及其一般卫生状况。

本方法根据霉菌和酵母菌特有的形态和培养特性，使用卵磷脂-吐温80-孟加拉红琼脂培养基，置25±1℃培养5d，计算所生长的霉菌和酵母菌数。

3菌种

序号

菌株名称

菌株编号

菌株来源

1

白色念珠菌

CMCC(F)98001，或其他等效标准菌株

中国医学细菌保藏管理中心

2

黑曲霉

CMCC(F)98003，或其他等效标准菌株

中国医学细菌保藏管理中心

注：用于适用性试验和检验过程中的质量控制。

4设备和材料

4.1恒温培养箱：25±1℃。

4.2旋涡混合器。

4.3三角瓶：150mL、250mL、500mL。

4.4试管：18mm×150mm。

4.5无菌平皿：直径90mm。

4.6无菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）。

4.7量筒：200mL。

4.8酒精灯。

4.9高压灭菌器。

4.10放大镜或/和菌落计数器。

4.11恒温水浴箱。

5培养基、冲洗液和试剂

5.1生理盐水：见微生物检验方法总则中附录。

5.2卵磷脂-吐温80-孟加拉红培养基

成分：蛋白胨 5.0g

葡萄糖 10.0g

磷酸二氢钾 1.0g

硫酸镁（MgSO4·7H2O） 0.5g

琼脂 20.0g

卵磷脂 1.0g

吐温80 7.0g

孟加拉红 0.033g

氯霉素 0.1g

蒸馏水 1000mL

制法：将上述各成分加入蒸馏水中，加热溶解，补足蒸馏水至1000mL，分装后，121℃高压灭菌15min，避光保存备用。

5.3pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液

成分：磷酸二氢钾3.56g

无水磷酸氢二钠5.77g

氯化钠4.30g

蛋白胨1.00g

蒸馏水1000mL

制法：称取上述成分，微温溶解，必要时滤过使澄清，分装，121℃高压灭菌15min，备用。

根据检样的特性，可选用生理盐水、pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或其他经验证的适宜溶液作为冲洗液。如需要，可在上述冲洗液灭菌前或灭菌后加入表面活性剂或中和剂等。

6操作步骤

6.1样品的稀释

用灭菌吸管吸取1:10的检液1mL注入到9mL稀释液（灭菌生理盐水或其他适宜的稀释液）中（注意勿使吸管接触液面），充分混匀，制成1:100检液。样品至少需进行1:10和1:100稀释，如样品含菌量高，还可再稀释成1:1000、1:10000、……等，每个稀释度应更换1支吸管。

6.2平板计数方法

6.2.1平板倾注法

用灭菌吸管吸取上述不同稀释度的检液各2mL，分别注入2个灭菌平皿内，每皿1mL。将融化并冷却至44~48℃的卵磷脂-吐温80-孟加拉红培养基倾注到平皿内，每皿15～20mL，使检液与培养基充分混合均匀。待琼脂凝固后，翻转平板，倒置于25±1℃培养箱内培养，逐日观察并记录培养至第5d的结果。

6.2.2薄膜过滤法

抑菌性较强的样品，若性质允许，可采用薄膜过滤法进行计数。薄膜过滤法操作步骤见微生物检验方法总则中5.2.3.2。冲洗完成后，将滤膜取出，过滤面朝上贴于卵磷脂-吐温80-孟加拉红培养基平板上，翻转平板，倒置于25±1℃培养箱内培养，逐日观察并记录培养至第5d的结果。

以稀释液代替检液，按照相应计数方法的规定进行阴性对照试验。

6.3菌落计数

6.3.1观察并记录稀释倍数及相应的霉菌和酵母菌数，必要时可用放大镜或菌落计数器辅助观察。计数结果以菌落形成单位（colony-formingunits，CFU）表示。

6.3.2选取菌落数在15～150CFU之间、无蔓延菌落生长的平板，根据菌落形态计数霉菌和酵母菌总数。菌落蔓延生长覆盖整个平板的可记录为菌落蔓延。

7结果与报告

7.1计算方法

7.1.1若只有一个稀释度的两个平板菌落数在适宜计数范围内，计算同一