CN106170547A 单元dna组合物的制备方法及dna连结体的制作方法 （高效基因设计技术研究协会）.docxVIP

(19)中华人民共和国国家知识产权局

(12)发明专利申请

(10)申请公布号CN106170547A

(43)申请公布日2016.11.30

(21)申请号201480073826.9

(22)申请日2014.09.05

(30)优先权数据

2014-0086902014.01.21JP

(85)PCT国际申请进入国家阶段日

2016.07.21

(86)PCT国际申请的申请数据

PCT/JP2014/0735792014.09.05

(87)PCT国际申请的公布数据

WO2015/111248JA2015.07.30

(71)申请人高效基因设计技术研究协会地址日本东京都

(72)发明人柘植谦尔板谷光泰

(74)专利代理机构北京市金杜律师事务所

11256

代理人杨宏军牛蔚然

(51)Int.CI.

C12N15/09(2006.01)

权利要求书2页说明书27页序列表48页附图21页

(54)发明名称

单元DNA组合物的制备方法及DNA连结体的制作方法

(57)摘要

CN106170547A本发明提供多个单元DNA的摩尔数更加一致的单元DNA组合物的制备方法及DNA连结体的制作方法。单元DNA组合物的制备方法包括下述工序：准备各自含有连结有附加序列的多个单元DNA中的每一种所述单元DNA的溶液的工序；和，在准备各溶液后，在单元DNA连结有附加序列的状态下，测定各溶液中的单元DNA的浓度，基于其结果分取各溶液，使各溶液中的单元DNA的摩尔数接近于彼此相同的工序。DNA连结体的制作方法包括下述工序：制备单元DNA组合物的工序、准备载体DNA的工序、用限制性内切酶从制备得到的溶液中的连结有附加序列的单元DNA中除去各附加序列的工序、和在除去工序后将载体DNA及

CN106170547A

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CN106170547A权利要求书1/2页

2

1.单元DNA组合物的制备方法，所述方法包括下述工序：

针对连结有附加序列的多个单元DNA,准备分别含有其中的每一种所述单元DNA的溶液的工序；和

在准备所述各溶液后，在所述单元DNA连结有附加序列的状态下，测定所述各溶液中的单元DNA的浓度，基于其结果分取所述各溶液，使各溶液中的单元DNA的摩尔数接近于彼此相同的工序。

2.如权利要求1所述的单元DNA组合物的制备方法，其中，所述连结有附加序列的单元DNA具有环状结构，所述附加序列为具有复制起点的质粒DNA序列。

3.如权利要求1或2所述的单元DNA组合物的制备方法，其中，所述单元DNA各自的碱基长度和与各单元DNA连结的附加序列的碱基长度的合计总长度的分布的标准偏差为相对于所述总长度平均值而言±20%以内。

4.如权利要求1至3中任一项所述的单元DNA组合物的制备方法，其中，与所述各单元DNA连结的附加序列的平均碱基长度为所述单元DNA的平均碱基长度的2倍以上。

5.如权利要求1至4中任一项所述的单元DNA组合物的制备方法，其中，所述单元DNA各自的长度为1600bp以下。

6.如权利要求1至5中任一项所述的单元DNA组合物的制备方法，其中，所述单元DNA用于制作含有由该单元DNA构成的组装DNA的DNA连结体，

所述方法中，准备含有所述单元DNA的溶液的工序包括以下工序：

以所述组装DNA中下述位置的序列附近的非回文序列为界，设计在端部具有非回文序列的所述单元DNA,所述位置是以用所述组装DNA的序列的碱基长度除以所述单元DNA的种类数时各段碱基长度相等的方式将所述组装DNA等分时的位置。

7.一种DNA连结体的制作方法，所述DNA连结体是用于微生物细胞转化的DNA连结体，所述用于微生物细胞转化的DNA连结体含有大于1个的下述组装DNA单元，所述组装DNA单元含有载体DNA和组装DNA,所述载体DNA包含在宿主微生物中有效的复制起点，所述方法包括下述工序：

利用权利要求1至6中任一项所述的方法制备单元DNA组合物的工序；

准备所述载体DNA的工序；

使用限制性内切酶、从制备得到的所述溶液中连结有附加序列的单元DNA中除去各自的附加序列的工序；和

在所述除去工序后，将所述载体DNA及所述各单元DNA彼此连结的工序，

其中，所述载体DNA及所述各单元D